الكشف عن تعبير MicroRNA في كليتي الغلوبولين المناعي A الفئران الكلوية
يوليو 8, 2020
وتشارك microRNAs في التسبب في اعتلال الكلية IgA. لقد طورنا طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كليتي نموذج فأر اعتلال الكلية IgA (فئران HIGA). ستسهل هذه الطريقة الجديدة التحقق من تورط miRNAs في اعتلال الكلية IgA.
يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقق بسهولة من تغير الحمض النووي الريبي الصغير في اعتلال الكلية IGA باستخدام نموذج حيواني صغير ، مما يجعل من الممكن دراسة اعتلال الكلية IGA دون خزعة الكلى البشرية. يمكن أن يوفر البروتوكول رؤى جديدة حول علم الوراثة لاعتلال الكلية IGA ، والتي يمكن أن تساعد في اكتشاف طرق تشخيصية وعلاجية جديدة لأمراض الكلى. بعد التأكد من تخدير الفأر بشكل صحيح ، استخدم المقص الجراحي والملقط لعمل شق خط الوسط من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات في جدار بطن الفأر وتحديد جانبي الكلى.
شق الضلوع والحجاب الحاجز لكشف القلب. بعد شق الأذين الأيمن ، قم بحقن PBS في البطين الأيسر حتى يتغير لون الكلى إلى اللون الأصفر الباهت ، مما يشير إلى أن جسم الفأر بالكامل مليء ب PBS. قطع الشريان الكلوي والوريد الكلوي والحالب ثم إزالة الكلى.
قم بتجانس عينات الكلى 30 ملليغرام باستخدام الخالط السيليكوني و 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول غوانيدين في درجة حرارة الغرفة. انقل المحللة إلى عمود تمزيق البوليمر الحيوي وقم بطرده عند 15،000 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. استمر في تنقية RBNA باتباع توجيهات المخطوطة.
بعد الغسيل النهائي ، أضف 30 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا وقم بطرده عند 8 ، 000 جم لمدة دقيقة واحدة لتصفية الحمض النووي الريبي. لتخليق (كدنا) ، قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على ميكرولترين من مزيج الحمض النووي ، وميكرولترين من مزيج النسخ العكسي ، وأربعة ميكرولترات من المخزن المؤقت بإجمالي ثمانية ميكرولترات لكل عينة. أضف ثمانية ميكرولترات من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من شريط أنبوبي مكون من ثمانية آبار.
تمييع الحمض النووي الريبي الكلي في ماء خال من النوكلياز. ثم أضف 12 ميكرولترا من محلول الحمض النووي الريبي الكلي إلى كل بئر من الشريط. ضع العينات في جهاز التدوير الحراري واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، ثم عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، قم بإعداد المزيج الرئيسي وفقا لتوجيهات المخطوطة ، ثم أضف 22.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة تفاعل 96 بئرا. أضف 2.5 ميكرولتر من (كدنا) المحضر إلى كل بئر. ضع لوحة التفاعل في جهاز PCR في الوقت الفعلي.
بعد ذلك ، قم ببرمجته للتنشيط الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، تليها 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمدد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تحديد التعبير الجيني باستخدام طريقة دلتا دلتا دلتا بالتصوير المقطعي المحوسب. تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في مستويات التعبير عن microRNAs في كلى فئران HIGA باستخدام كليتي فئران Balb / c كمراقبة.
تم قياس مستويات التعبير عن ثلاثة microRNAs مرتبطة باعتلال الكلية IGA. تمت مقارنة مستويات التعبير النسبي عن الحمض النووي الريبي الصغير للمجموعتين باستخدام اختبار T مع P أقل من 0.05 وهو ذو دلالة إحصائية. تم التعبير عن miR-155-5p عند مستويات أعلى بمقدار 3.3 أضعاف في مجموعة HIGA مقارنة بالمجموعة الضابطة ، وتم التعبير عن miR-21-5p عند مستويات أعلى بمقدار 1.58 ضعف.
لميختلف تعبير miR-1461-5p بشكل كبير بين المجموعتين. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم ارتداء قناع وقفازات وقبعة والحفاظ على طاولة المختبر وأدواتها نظيفة لمنع النوكلياز في البيئة من التأثير على التجربة. هذه الطريقة التجريبية قيد الاستخدام العملي حاليا في مختبرنا.
الهدف هو إنشاء طرق تشخيصية وعلاجية جديدة لاعتلال الكلية IGA.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة موثوقة للكشف عن مستويات تعبير microRNA في كلى نموذج فأر مصاب باعتلال الكلى الناتج عن IgA. وتتيح هذه الطريقة استقصاء دور microRNAs في اعتلال الكلى الناتج عن IgA دون الحاجة إلى إجراء خزعات من كلى بشرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم أمراض الكلى
- أبحاث الحمض النووي الريبي الميكروي (MicroRNA)
- النماذج الحيوانية
خلفية علمية
- اعتلال الكلية بـ IgA هو مرض كلوي يتميز بترسب IgA في الكبيبات الكلوية.
- تلعب microRNAs دوراً هاماً في إمراضية العديد من الأمراض، بما في ذلك اضطرابات الكلى.
- يمكن أن يوفر فهم تعبير microRNA رؤى حول آليات المرض.
- غالباً ما تتطلب الطرق الحالية لدراسة microRNAs إجراءات جراحية تداخلية.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتقييم مستويات microRNA في نموذج فأر مصاب باعتلال الكلية بـ IgA.
- تسهيل الأبحاث حول الجوانب الجينية لاعتلال الكلية بـ IgA.
- استكشاف النهج التشخيصية والعلاجية المحتملة لأمراض الكلى.
الطرق المستخدمة
- استخدام فئران HIGA كنموذج لمرض اعتلال الكلية بـ IgA.
- تخدير الفأر قبل إجراء الجراحة.
- التقنيات الجراحية للوصول إلى الكلى، بما في ذلك الشق الناصف وإزالة الأعضاء.
- تروية الفأر بـ PBS للتحضير لاستخراج الكلى.
النتائج الرئيسية
- تتيح الطريقة المطورة التحقق السهل من تغيرات microRNA في اعتلال الكلية بـ IgA.
- يمكن أن تؤدي الرؤى المكتسبة من هذه الطريقة إلى تطوير أدوات تشخيصية جديدة.
- إمكانية اكتشاف استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج اعتلال الكلية بـ IgA.
- الاستغناء عن الحاجة إلى خزعات الكلى البشرية في الدراسات الأولية.
الاستنتاجات
- تعزز هذه الطريقة من فهم دور الـ microRNA في اعتلال الكلية بـ IgA.
- وهي تفتح آفاقاً جديدة للأبحاث المتعلقة بعلم الوراثة لأمراض الكلى.
- وقد يؤثر هذا النهج بشكل كبير على التطورات التشخيصية والعلاجية المستقبلية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يتيح هذا البروتوكول لفرق البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية تحديد ملف تعبير microRNA في نموذج مصدق للفئران المصابة باعتلال الكلية بـ IgA، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية في برامج أمراض الكلى. ومن خلال توفير طريقة قابلة للتكرار للكشف عن مستويات miRNA المتغيرة دون الحاجة إلى خزعات بشرية، فإنه يسهل الاكتشاف المبكر للمؤشرات الحيوية والأهداف العلاجية مع تحسين الثقة التنبؤية. ويتماشى هذا النهج مع جهود مرحلة الاكتشاف لاستقصاء آليات المرض وتحديد أولويات المرشحين للتطوير قبل السريري.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس التغيرات في تعبير miRNA المرتبط بالمرض في فئران HIGA مقارنة بالمجموعات الضابطة.
- القيمة التشغيلية: توفر سير عمل موثوق للتحقق الوظيفي من الأهداف باستخدام qRT-PCR لقياس مستويات miR-155-5p و miR-21-5p و miR-146a-5p.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال تحديد جزيئات miRNA ذات تغيرات طي ذات دلالة إحصائية (على سبيل المثال، 3.3-fold لـ miR-155-5p) كعلامات بيولوجية أو أهداف محتملة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر بيانات كمية وقابلة للتكرار عن تعبير miRNA، وهي مناسبة لتوحيد المقاييس في حملات فحص الاكتشاف.
- القيمة التشغيلية: يؤسس بروتوكولاً موحداً لتنقية RNA وتخليق cDNA يتوافق مع منصات qRT-PCR عالية الإنتاجية.
- جاهزية المقايسة: يولد قيم CT مطبعة باستخدام طريقة delta-delta CT، مما يتيح المقارنة بين العينات وتأكيد النتائج الإيجابية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: يستخدم نموذج فأر HIGA ذو الصلة بالمرض للربط بين نتائج الاكتشاف والتحقق قبل السريري من المسارات التي تتوسطها الـ miRNA.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح تقييم التغيرات في تعبير الـ miRNA المرتبطة بترسب IgA، مما يقلل من الغموض في آلية الاستهداف قبل تحديد المركب الرائد.
- الاستمرارية قبل السريرية: يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير قراءات كمية ومتسقة من أنسجة الكلى عبر مجموعات الدراسة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشافات المبكرة، حيث تدعم اختبار الفرضيات في عملية التحقق من الأهداف، وتنتج مخرجات كمية لسير عمل الفرز والتحليلات التي تساهم في اتخاذ قرارات تحديد المركبات الرائدة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتيح توضيح المسارات من خلال قياس تحولات تعبير miRNA المرتبطة بإمراضية اعتلال الكلية بـ IgA في نموذج فأر جيني.
- الفحص: توفر بيانات miRNA كمية وموحدة مناسبة لتقييم تأثيرات المركبات على المسارات المستهدفة في المقايسات اللاحقة.
- التحليلات: تُنتج قيم delta-delta CT ومقاييس التغير النسبي (fold-change) التي تسمح للفرق بمقارنة الظروف وتقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبارات T-tests.
- الأبحاث الانتقالية: تربط نتائج miRNA في مرحلة الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال استخدام نموذج معتمد لاعتلال الكلية بـ IgA ذو صلة ظاهرياً.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تضع بروتوكولاً قابلاً لإعادة الاستخدام لاستخلاص RNA وتقنية qRT-PCR يمكن تطبيقه على أهداف miRNA متعددة عبر مشاريع أمراض الكلى.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي عبر القياس المباشر لاختلال تنظيم miRNA في نموذج مرضي.
- القيمة التشغيلية: ضمان قابلية التكرار والتوحيد القياسي من خلال تحديد بارامترات تنقية RNA، وتخليق cDNA، وqRT-PCR (على سبيل المثال، طرد مركزي بسرعة 8,000 G، وحضن عند 37°C).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المتابعة أو التوقف من خلال توفير بيانات تعبير ذات دلالة إحصائية (p<0.05) لتحديد أولويات الأهداف ذات الارتباط القوي بالمرض.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمؤشرات الحيوية القائمة على miRNA أو الأهداف العلاجية بناءً على مقدار التغير في التعبير (fold-change) وقابلية التكرار.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في جراحة القوارض، والتعامل مع الـ RNA، وتقنية qRT-PCR لمنع التحلل بفعل النوكلياز وضمان سلامة العينات.
- يعتمد على توفر معدات التجانس، وجهاز طرد مركزي، وجهاز دورات حرارية، وجهاز PCR في الوقت الحقيقي مزود بكاشف الفلورة.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق فيما يخص كمية الـ RNA المدخلة (30 mg من الكلية)، وأحجام الكواشف (700 μL من كاشف التحلل)، وظروف الدورات الحرارية (تفعيل عند 95°C، و40 دورة).
- يتطلب تطويع مجموعات البادئات لأهداف miRNA محددة مع الحفاظ على درجات حرارة ثابتة للارتباط (55°C) والتمديد (70°C).
- يقتصر على تحليل الـ RNA النهائي؛ ولا يوفر دقة مكانية أو تحليلًا على مستوى الخلية الواحدة داخل أنسجة الكلية دون استخدام منهجيات إضافية.
