عزل وإثراء الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية للزراعة العضوية

الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد قريبة في ظهارة الرئة البعيدة التي تم تطويرها باستخدام هذا البروتوكول. توفير نموذج قابل للتتبع لدراسة الآليات الأساسية للحفاظ على أنسجة الرئة أو إعادة التشكيل المرتبطة بالأمراض ، ويخدم منصة فعالة لاكتشاف الأدوية والتحقق من صحتها. هذا البروتوكول متوافق مع مناهج التجزئة الخلوية الأخرى لتفكك الأنسجة.

وبما أن الخلايا السلفية الظهارية معزولة عن المقصورات التشريحية المختلفة ، فإنها تحافظ على هويتها الموضعية في المختبر ، فيمكن استخدامها لنمذجة الاختلافات الإقليمية في استجابات الرئة للمنبهات الخارجية أو الداخلية. يمكن استخدام تقنية المستوى هذه لعزل مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا الظهارية بما في ذلك الخلايا السلفية الخاصة بالمنطقة التي يمكن زراعتها لإنتاج ذرية متمايزة متخصصة تمثل منطقة المنشأ. عند تلقي أنسجة الرئة ، افصل القصبة الهوائية القريبة والشعب الهوائية عن ظهارة الرئة البعيدة ، والتي تحتوي على ممرات هوائية صغيرة يبلغ قطرها ملليمترين أو أقل ، والأنسجة المتني المحيطة.

ضع العينات في أطباق بتري فردية معقمة مقاس 150 × 15 ملم وقم بتقطيع عينة الأنسجة البعيدة إلى قطع مكعبة بحجم سنتيمتر واحد تقريبا. ضع القطع في أنبوب نظيف 50 ملم واغسل المناديل ثلاث مرات باستخدام HBSS المبرد الطازج لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، انقل المناديل إلى طبق بتري جديد وجفف القطع بمناديل معقمة مضادة للوبر.

ثم استخدم الملقط والمقص لإزالة أكبر قدر ممكن من غشاء الجنب الحشوي قبل فرم الأنسجة إلى شظايا قطرها ملليمترين تقريبا. لهضم شظايا الأنسجة ، أضف 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الليبراز و 25 ميكروغراما لكل مليلتر من الحمض النووي إلى 25 ملليلترا من HBSS المعقم في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. وأضف ما يقرب من جرامين إلى ثلاثة جرامات من الأنسجة المفرومة إلى الأنبوب.

ثم ضع المناديل على حرارة 37 درجة مئوية مع الرج المستمر بمعدل 900 دورة في الدقيقة لمدة 40 إلى 60 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لترثب الأنسجة المهضومة لمنع تكوين التكتل. في نهاية الحضانة ، استخدم حقنة سعة 10 مليلتر مزودة بإبرة قياس 16 لترتريتورات الأنسجة خمس مرات.

ثم استخدم ماصة ذات تجويف عريض لتمرير التعليق عبر سلسلة من مصافي الخلايا تحت ضغط التفريغ كما هو موضح. بعد غسل المصفاة الأخيرة ب 20 مل من HBSS plus لجمع أي خلايا متبقية ، قم بالطرد المركزي للمرشحات لجمع الخلايا المعزولة. بعد التخلص من المواد الطافية ، أضف ملليلترا واحدا من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء إلى الكريات باستخدام ماصة لطيفة قبل احتضان الخلايا لمدة دقيقة واحدة من الثلج.

في نهاية الحضانة ، أضف 10 إلى 20 مل من HBSS بالإضافة إلى المخزن المؤقت لتحييد التحلل وجمع الخلايا المتبقية عن طريق الطرد المركزي. استنفد الخلايا البطانية الإيجابية CD31 والخلايا المناعية الإيجابية CD45 من مجموعة الخلايا الكلية باستخدام حبات CD31 و CD45 الدقيقة المقترنة بالجسم المضاد CD31 و CD45 أحادي النسيلة المضاد للإنسان وأعمدة LS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بالنسبة لتلوين سطح الخلية ل FACS ، أضف الأجسام المضادة الأولية المناسبة ذات الأهمية بالتركيز المطلوب واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من HBSS plus وقم بتسمية الخلايا بالتركيز المناسب من الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلوروفور لمدة 30 دقيقة على الجليد حسب الاقتضاء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من HBSS plus وأعد تعليق الخلايا عند مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر من HBSS بالإضافة إلى التركيز قبل تصفية الخلايا إلى أنابيب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر من خلال غطاء مصفاة لضمان تكوين معلق خلية واحدة. ثم أضف ميكروغراما واحدا لكل مليلتر من DAPI لتلطيخ الخلايا القابلة للنفاذ.

لإثراء الخلايا السلفية الظهارية القريبة للأنسجة ، قم بتشريح المسالك الهوائية القريبة من الرئتين واستخدم المقص لفتح الشعب الهوائية بطولها لكشف التجويف. قم بتغطية المناديل في 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الليبراز لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع رج مستمر على الخلاط. في نهاية الحضانة ، انقل الأنسجة إلى طبق معقم مقاس 150 × 15 ملم واستخدم مشرطا لكشط سطح مجرى الهواء برفق لتجريد الخلايا الظهارية اللمعية تماما من الأنسجة.

بعد ذلك ، اغسل الطبق بخمسة ملليلتر من HBSS المعقم بالإضافة إلى المخزن المؤقت لجمع كل الخلايا الظهارية اللمعية التي تم إزاحتها ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 ملليلترا. قم بترتيتوري التعليق خمس مرات على التوالي باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر للحصول على معلق أحادي الخلية. ثم جمع التعليق عن طريق الطرد المركزي.

ثم أعد تعليق الحبيبات في HBSS الطازج بالإضافة إلى المخزن المؤقت على الجليد. استخدم المقص لقطع الأنسجة القصبة الهوائية المتبقية على طول حلقاتها لتوليد شرائح صغيرة من الأنسجة. في طبق جديد ، استخدم شفرة حلاقة أحادية الجانب لفرم الشرائط إلى قطع أصغر ونقل قطع المناديل إلى أنابيب C تحتوي على ملليلترين من الليبراز لكل أنبوب.

ثم استخدم بروتوكول الرئة البشري الثاني على جهاز الفصل الآلي gentleMACS لفصل الأنسجة ميكانيكيا بشكل أكبر. في نهاية التفكك ، انقل ما يقرب من جرامين من الأنسجة القريبة المفرومة إلى 50 مليلتر أنابيب مخروطية تحتوي على 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الليبراز و 25 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول الحمض النووي. في نهاية حضانة مدتها 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز ، قم بتصفية ملاط الأنسجة من خلال سلسلة من المصافي كما هو موضح لأنسجة الرئة البعيدة وأضف حجما متساويا من HBSS بالإضافة إلى المخزن المؤقت إلى المرشح لوقف الهضم.

أضف خلايا مجرى الهواء القريب اللمعية المعزولة إلى الأنبوب واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. يمكن بعد ذلك إثراء الخلايا بعزل الميكروبيدات وتلطيخها لعلامات سطح الخلية ذات الأهمية كما هو موضح لخلايا أنسجة الرئة البعيدة. تشمل المسالك الهوائية القريبة المبطنة بظهارة طبقية زائفة خلايا سلفية قاعدية وفيرة متفاعلة مناعية لبروتين الغشاء NGFR.

في المقابل ، تشتمل الخلايا الظهارية المبطنة للحويصلات الهوائية على مجموعة فرعية تظهر نشاطا مناعيا للغشاء القمي مع الجسم المضاد أحادي النسيلة HTII-280 الذي يوحي بهوية الخلية السنخية من النوع الثاني. يؤدي استنفاد الخرزة المغناطيسية للدم الأحمر الملوث والخلايا المناعية والبطانية إلى إثراء كبير لمجموعات الخلايا الظهارية في كل من عينات الأنسجة البعيدة والقريبة مع زيادات مقابلة في كفاءة FACS. يؤدي استنفاد FACS الإضافي إلى مجموعات خلايا بعيدة عالية الإثراء يمكن تجزئتها بشكل إضافي بناء على تلطيخ سطح NGFR أو HTII-280.

ثقافات الخلايا الظهارية الإيجابية للرئة البعيدة HTII-280 عضيات سريعة التوسع بمتوسط كفاءة تشكيل مستعمرة تبلغ 10٪ يكشف تلطيخ التألق المناعي لثقافات اليوم 30 أن التجويف المحتوي على العضيات يتكون في الغالب من الخلايا الظهارية البعيدة الإيجابية HTII-280 و SPC. تؤدي العضيات الظهارية القريبة للرئة المزروعة من الخلايا الإيجابية NGFR إلى تكوين تجويف يحتوي على عضيات في اليوم 30 من الثقافة بمتوسط كفاءة تشكيل مستعمرة تبلغ 7.8٪ يعد التحسين التجريبي لارتباط الأنسجة الأنزيمية أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على الحلقات السطحية مما يسمح بتلوين التألق المناعي وإثراء مجموعات فرعية للخلايا الظهارية القابلة للحياة للجيل اللاحق من الثقافات المنظمة الخاصة بالمنطقة. يمكن تكييف هذه الطريقة لتحديد وإثراء مجموعات فرعية من الخلايا المناعية والأوعية الدموية واللحمية والظهارية وتطوير نماذج الزراعة المشتركة باستخدام منصات الرقائق العضوية ثلاثية الأبعاد.

لقد وصفنا مؤخرا استخدام العضيات السنخية التي تم إنشاؤها باستخدام هذه التقنية كمنصة لدراسة عدوى SARS-CoV-2 في ظهارة الرئة البشرية وللتحقق من صحة أدوية COVID-19.