ثلاثي الأبعاد موتور العصب الجهازية جيل

يسهل هذا البروتوكول التحقيق في الآليات الكامنة وراء تطور ومرض حزم المحاور باستخدام العصب الحركي العضوي المشتق من خلايا iPS البشرية خارج الجسم. بمجرد زراعة رقائق الزراعة الدقيقة الكروية العصبية والمصنوعة حسب الطلب ، يمكن إنشاء حزم محورية أحادية الاتجاه تلقائيا واستخدامها في العديد من التجارب النهائية. يمكن أن تسهل العضوية العصبية الحركية فحص واختبار الأدوية لأمراض الخلايا العصبية الحركية ، بما في ذلك LS ، من خلال توفير نموذج فسيولوجي أكثر سابقا في الأنظمة المختبرية.

في غطاء الدخان ، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، قم بتوزيع ثلاثة ملليلتر من SU-8 2100 على رقاقة سيليكون نظيفة من الأسيتون وضع الرقاقة في وسط المغطي الدوار. قم بتثبيت الرقاقة بالمكنسة الكهربائية وقم بتدوير الرقاقة بمعدل 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان لطلاء SU-8 بشكل موحد عبر سطح الرقاقة ، ثم قم بتدوير الرقاقة بمعدل 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية بتسارع 300 دورة في الثانية للحصول على طبقة سميكة 150 ميكرون من مقاومة الضوء على الرقاقة. بعد الخبز الناعم ، اضبط القناع الضوئي على تقويم القناع وقم بتعريض الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 ثانية.

بعد الخبز على طبق ساخن ، قم بتطوير الرقاقة لمدة 10 إلى 20 دقيقة في مطور مقاوم للضوء مع تحريض على شاكر مداري ، وتغيير المحلول النامي مرة واحدة أثناء العملية. لتحضير الطبقة السفلية من الرقاقة لزراعة الأنسجة ، اسكب PDMS المحضرة حديثا على الرقاقة إلى السماكة المطلوبة وقم بإزالة الخليط في غرفة مفرغة. عالج PDMS في الفرن لمدة ثلاث ساعات على الأقل عند 60 درجة مئوية.

بعد التبريد ، استخدم شفرة لقطع PDMS المعالج من الرقاقة ، ثم استخدم PDMS غير المعالج مع الخبز لربط خزان متوسط بالطبقة السفلية PDMS للحصول على شريحة زراعة أنسجة PDMS المجمعة. لتحضير شريحة PDMS لتكوين عصب عصب حركي ، قم بتعقيم الرقاقة وزجاج مجهر 76 × 52 ملم في طبق بتري يحتوي على 70٪ إيثانول لمدة ساعة واحدة على الأقل. في نهاية الحضانة ، ضع الرقاقة على زجاج المجهر المبلل.

بعد التجفيف طوال الليل ، يجب أن تلتصق الرقاقة بالزجاج. ضع قطرة 30 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي المخففة في DMEM / F12 على جانب واحد من مدخل القناة وشفط المحلول من الجانب الآخر من المدخل لتغطية سطح القناة الدقيقة بالمصفوفة. ثم احتضان شريحة PDMS بمحلول الطلاء في طبق بتري لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

للحث على تمايز خلايا iPS ثلاثية الأبعاد إلى الخلايا العصبية الحركية ، قم بالبذور أربعة أضعاف 10 إلى خلايا iPS الرابعة لكل بئر في العدد المناسب من الآبار لصفيحة قاع U مكونة من 96 بئر في 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا المغذية والخالية من المصل المكملة ب 10 ميكرومولار Y-27632. في اليوم التالي ، استبدل المادة الطافية في كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسط KSR مكملة ب 10 ميكرومولار SB431542 و 100 نانومولار LDN-193189. في اليومين الثاني والثالث ، استبدل المواد الطافية ب 100 ميكرولتر من وسط KSR مكملا ب 10 ميكرومولار SB431542 ، و 100 نانومولار LDN-193189 ، وخمسة ميكرومولار DAPT ، وخمسة ميكرومولار SU5402 ، وحمض ريتينويك ميكرومولار واحد ، وناهض واحد ميكرومولار.

في اليومين الرابع والخامس ، استبدل المواد الطافية بمزيج من 75٪ من وسط KSR و 25٪ من وسط N2 مكمل ب 10 SB431542 ميكرومولار ، و 100 LDN193189 نانومولار ، وخمسة ميكرومولار DAPT ، وخمسة ميكرومولار SU5402 ، وحمض ريتينويك ميكرومولار واحد ، وناهضات ميكرومولار منعمة. في اليومين السادس والسابع ، استبدل المواد الطافية بمزيج من 50٪ من وسط KSR و 50٪ من وسط N2 مكمل بخمسة ميكرومولار DAPT ، وخمسة ميكرومولار SU5402 ، وحمض ريتينويك ميكرومولار واحد ، وناهض واحد مملس ميكرومولار. في اليومين الثامن والتاسع ، استبدل المواد الطافية بمزيج من 25٪ من وسط KSR و 75٪ من وسط N2 مكمل خمسة ميكرومولار DAPT ، وخمسة ميكرومولار SU5402 ، وحمض ريتينويك ميكرومولار واحد ، وناهض واحد ميكرومولار مماع.

في اليومين 10 و 11 ، استبدل المواد الطافية بوسط N2 مكمل بخمسة ميكرومولار DAPT ، وخمسة ميكرومولار SU5402 ، وحمض ريتينويك ميكرومولار واحد ، وناهض واحد ممسر ميكرومولار. في اليوم 12 ، استبدل المواد الطافية في كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسط النضج مع 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ لكل بئر. للحث على تكوين عضوي العصب الحركي ، استبدل محلول الطلاء في شريحة PDMS ب 150 ميكرولتر من وسط النضج المكمل ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ واستخدم طرف ماصة دقيقة عريضة التجويف لإضافة الخلايا العصبية الحركية الكروية برفق من بئر واحد من اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى مدخل القناة الدقيقة للرقاقة.

ضع خزانا صغيرا من الماء المعقم بالقرب من شريحة زراعة الأنسجة في الطبق لمنع التبخر المتوسط وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. كل يومين إلى ثلاثة أيام ، استبدل نصف وسط الاستزراع المستنفد من مركز الخزان المتوسط بوسط نضج طازج مكمل ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ. ستنمو المحاور من الخلايا العصبية الحركية الكروية إلى القناة ، وتتجمع تلقائيا في حزمة واحدة على مدى أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع لتشكيل عصب عضوي حركي.

تتمايز الخلايا العصبية الحركية في غضون 12 إلى 14 يوما في إجراءات التمايز ثلاثية الأبعاد. الأهم من ذلك ، أن أكثر من 60٪ من الخلايا تعبر عن علامة الخلايا العصبية الحركية HB9 أثناء التمايز وحوالي 80٪ من الخلايا الموجودة في الخلايا الكروية للخلايا العصبية الحركية إيجابية SMI32. مع عمل القناة الدقيقة كأدلة فيزيائية ، تستطيل المحاور من الخلايا العصبية الحركية الكروية لتشكل تفاعلا محوريا محوريا في غضون 24 ساعة من إدخال الكروي.

وصلت المحاور إلى مركز القناة الدقيقة في غضون الأيام الثلاثة إلى الأربعة التالية ، وامتدت إلى الطرف الآخر من القناة الدقيقة بعد 10 أيام إضافية. يمكن جمع عضيات الأعصاب الحركية من الرقاقة للتحليل البيولوجي عن طريق فصل PDMS عن زجاج المجهر. يمكن بعد ذلك تشريح حزم المحاور وأجسام الخلايا وعزلها تحت المجهر باستخدام سكين جراحي أو ملاقط.

في حزم المحاور من عضيات الأعصاب الحركية ، لا يتم الكشف عن بروتينات العلامات المتغصنة عن طريق النشاف الغربي. من المهم التأكد من إسقاط الكرويات بالكامل إلى الأسفل داخل شريحة الثقافة. أظهرنا فحص المواقع ويمكن أن يساعد الجزء السفلي في تحديد موقع الكرة في الشريحة.

يمكن فحص حزم المحاور العصبية المعزولة بحثا عن طرق إضافية مختلفة. يمكن الحصول على كمية كبيرة من المحاور واستخدامها في المقايسات الكيميائية الحيوية التي تتطلب مواد كبيرة.