التخفيف من مرفق الخلايا المنقولة بالدم إلى يزرع المعادن من خلال CD47-المشتقة الببتيد تجميد

ويتضمن هذا البروتوكول استراتيجية كيميائية جديدة لإلحاق الببتيدات العلاجية بالأسطح المعدنية، كما أنه يمكن أن يحسن التوافق الحيوي لمجموعة واسعة من المواد الحيوية الفلزية. هذه هي تقنية عالمية وقوية لإلحاق الببتيدات والبروتينات العلاجية إلى الأسطح المعدنية العارية من النباتات الحيوية. لقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحسين التوافق الحيوي للدعامات المعدنية عن طريق إلحاق الببتيدات CD47 من أجل منع استجابات الالتهاب التي يتم تشغيلها عن طريق الدعامات.

تبدأ عن طريق غسل القسائم احباط الفولاذ المقاوم للصدأ أو أقراص شبكة مع 2-isopropanol في شاكر لمدة خمس دقائق. قم بإجراء هذا الغسل مرتين، ثم اغسل العينات مرتين بالكلوروفورم لمدة 10 دقائق لكل غسيل. ضع عينات الفولاذ المقاوم للصدأ المطهرة في فرن عند درجة حرارة 220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

غمر رقائق المخبوزات أو أقراص شبكة في 0.5٪ محلول مائي من PABT واحتضانها في شاكر لمدة ساعة واحدة. اغسل العينات المعدلة من PABT بالماء المقطر المطحون خمس مرات. نقل العينات إلى قارورة جديدة وتكرار يغسل.

علاج العينات مع TCEP لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. Degas deionized المياه المقطرة في قارورة أسفل جولة مع جهاز توليد فراغ ، مثل مزيل الهيملي ، وغسل رقائق أو أقراص شبكة مع المياه ديغاوسيد خمس مرات. نقل العينات إلى قارورة جديدة وتكرار يغسل.

إعداد خمسة ملليلتر من 1٪ PEI-PDT حل عن طريق تخفيف 212.5 ميكرولترات من المخزون PEI-PDT و 125 ميكرولترات من 0.4 خلات الصوديوم المولر في المياه دي الغاز. احتضان عينات الفولاذ المقاوم للصدأ غسلها مع 1٪ PEI-PDT. استبدال الهواء مع غاز الأرجون، وختم قوارير محكم، وخلطها على شاكر لمدة ساعة واحدة.

المضي قدما على الفور مع اقتران الببتيد أو تخزين العينات في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. إعداد مليغرام واحد لكل ملليلتر ببتيد الإنسان CD47 حل الأسهم عن طريق حل مسحوق CD47 الببتيد البشري في degassed 50٪ حمض الخليك, ثم إعداد حل العمل عن طريق حل 500 ميكرولترات من المخزون في 4.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ثنائي الغاز. احتضان العينات المغلفة PEI-PDT المغلفة مع حل العمل من CD47 الببتيد في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لمدة ساعة واحدة.

عند الانتهاء، قم بغسل العينات المغلفة ببتيد CD47 كما هو موضح في المخطوطة النصية. بعد طلاء رقائق معدنية مع إما الببتيد CD47 أو الببتيد المشوش، وقطع أنابيب PVC ربع بوصة إلى ثلاث قطع طولها 38 سنتيمترا وإدراج ما يصل إلى ثمانية غير معدلة، الببتيد المشوش، أو ببتيد CD47- تعديل رقائق المعادن في ثلاثة أنابيب مختلفة. جمع 30 ملليلتر من الدم من متبرعين أصحاء بشرية خالية من أي الأدوية المضادة للصفائح الدموية، قبل تحميل الحقنة مع ملليلتر واحد من سيترات الصوديوم 4٪ لمنع تخثر الدم الذي تم جمعه.

وضع 10 ملليلتر من الدم في كل أنبوب باستخدام حقنة 10 ملليلتر وربط نهايات مع محولات معدنية. ضع الأنابيب المليئة بالدم على عجلات جهاز حلقة تشاندلر ومرر الدم على طول الرقائق المعدنية عن طريق دوران العجلات عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. اصفي الدم من الأنابيب وتخلص منه وفقا لمتطلبات IRB، ثم قطع الأنابيب بمشرط لاسترداد رقائق.

إعداد 2٪ حل الجلوتارالديهيد عن طريق تخفيف 70٪ حل في العازلة cacodylate الصوديوم مع 0.1 كلوريد الصوديوم الضرس. احتضان رقائق في حل 2٪ غلتارالدهيد لمدة 15 دقيقة وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. قبل تحليل رقائق المعادن، وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.

دافئة ثمانية ملليلتر من برنامج تلفزيوني في حمام مائي 37 درجة مئوية. إعداد 10 ملليمتر CFDA صبغ الأسهم الحل عن طريق إضافة 90 ميكرولترات من DMSO إلى قارورة CFDA واحد، ثم إعداد حل العمل عن طريق إضافة 75 ميكرولترات من CFDA الأسهم إلى برنامج تلفزيوني دافئ. عكس أنبوب عدة مرات لخلط وتغطية مع رقائق الألومنيوم.

ضع كل احباط في ملليلتر واحد من صبغة CFDA في لوحة 24-well. غطي اللوحة برقائق الألومنيوم ويحضن اللوحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم اغسل الرقائق ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وصورها بمجهر مفلور. تم تحديد كمية تركيز TAMRA المترافقة مع التهاماتيد CD47 لتحديد كثافة الجمود القصوى للببتيد على السطح المعدني.

وكان الحد الأقصى للاحتفاظ بالببتيد حوالي 180 نانوغرام لكل سنتيمتر مربع، وهو ما تحقق بتركيز المدخلات 100 ميكروغرام لكل ملليلتر. وقد تم تثبيت TAMRA متقارن CD47 الببتيد على الأسطح المعدنية المعدلة أكثر من ذلك من قبل المجهر الفلوريسين، والتي أظهرت الفلوريسنس موحدة المنبعثة من سطح الأقراص الشبكية PEPTIDE CD47 مترافق TAMRA. تم الكشف عن الحد الأدنى من الفلور على سطح الشبكات التحكم التي تفتقر إلى التعديل، وبالتالي استبعاد غير ملزمة خصيصا TAMRA الببتيد CD47 كمصدر رئيسي للفلوريسنس.

كما تم التأكيد على أن الأسطح المغلفة ببتيد CD47 تظهر انخفاضاً كبيراً في مرفق الخلايا المنقولة بالدم مقارنة بعناصر الببتيد المعدلة وغير المعدلة. كانت الخلايا الأحادية المعزولة من خلايا معطف الجرذان بافي مستزرعة على رقائق الفولاذ المقاوم للصدأ المعدلة من قبل CD47 والمعدلة من الجرذان. ولوحظ توهين بنسبة 58٪ من المرفق أحادية حادة، وتحويلها إلى الضامة، وانتشار الضامة على الأسطح الوظيفية.

أثناء محاولة هذا البروتوكول، من المهم جداً تنفيذ الخطوات التي تنطوي على المياه أو الكواشف التي يتم إجراؤها في أسرع وقت ممكن والتقليل من التعرض للأكسجين. تقنيتنا تعدل بشكل انتقائي التفاعل الخلوي مع الأسطح المعدنية وقياس نوع الخلية النموذجية، مثل RT-PCR، قياس التدفق الخلوي، والفلوروس المناعي، متوافقة مع هذه التقنية. عندما وضعت لمجموعة من الببتيد النشطة بيولوجيا، يمكن أن تكون هذه التكنولوجيا مفيدة في زيادة التوافق الحيوي في واجهة المواد الأنسجة.