التقييم الوظيفي لمتغيرات BRCA1 باستخدام محررات قاعدة CRISPR-بوساطة

من خلال تحفيز الطفرات نقطة بكفاءة باستخدام محرر قواعد السيتوسين كريسبر بوساطة، وظيفة المتغيرات BRCA1، وهو أمر مهم للوقاية من الأمراض وتشخيصها، يمكن تحديدها. وميزة هذه التقنية هي أنها تحور بشكل مباشر BRCA1 الذي يعبر عنه داخليًا، والذي يتغلب على الحد من التقييم الوظيفي باستخدام BRCA1 المعبر عنه خارجيًا. يمكن استخدام تحديد فقدان طفرات وظيفة BRCA1 للتنبؤ بفرصة الإصابة بالسرطانات المرتبطة بطفرات BRCA1 ، مثل سرطان الثدي والمبيض والبروستاتا والبنكرياس.

ويمكن أيضا أن تستخدم للعثور على أهداف المخدرات المحتملة من خلال البحث عن الجينات الأساسية التي تنخفض قدرتها على البقاء من خلال استنفاد وظيفية. للبدء ، والحصول على تسلسل الجينوم BRCA1 من GenBank في NCBI والبحث في المواقع المستهدفة 20 زوج قاعدة مع تسلسل الزخارف protospacer المجاورة ، NGGNCCN ، حول طفرة الفائدة. وينبغي أن يكون موجودا في نطاق طفرة الفائدة في غضون أربع إلى ثماني نيوكليوتيدات في نهاية PAM-اضم من تسلسل الهدف RNA الدليل.

طلب اثنين من oligonucleotides مجانية لكل دليل RNA. ل oligonucleotides إلى الأمام، إضافة CACCG إلى 5'نهاية تسلسل الدليل و لالعكاس oligonucleotides، إضافة إلى 5'نهاية وجيم إلى 3'نهاية. بعد تلقي oligonucleotides، resuspend لهم في الماء المقطر إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومولار.

مزيج اثنين من أوليغنوكليوتيدات مجانية إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار مع T4 ربط العازلة وتسخينها إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ثم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة لالحن. هضم pRG2 باستخدام إنزيم تقييد Bsa1 لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية، ثم تشغيل المنتج المهضم على جل agarose 1٪وتنقية الفرقة الحجم المناسب. Ligate oligonucleotide الدوبلوج إلى الحمض النووي ناقلات باستخدام الحمض النووي التي تم شراؤها ligase وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتحويلها إلى خلايا DH5 ألفا المختصة.

إضافة المحولات إلى لوحة أغار التي تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين واحتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تنقية الحمض النووي البلازما من عدة محولات وتحليل تسلسلات رنا دليلها من قبل تسلسل سانجر مع التمهيديات التي رئيس في المروج U6. البذور خمس مرات 10 إلى الخامس HAP1-BE3 الخلايا في بئر في 24-جيدا لوحات قبل يوم واحد من transfection والثقافة لهم للوصول إلى 70-80٪ التقاء لTransfeence.

Transfect BRCA1 توجيه الاستهداف RNAs باستخدام الكواشف transfection شراؤها وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام ميكروغرام واحد من BRCA1 توجيه الاستهداف RNAs لحث CG لتحويل TA في المواقع المستهدفة BRCA1 ثم احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية والثقافة الفرعية كل ثلاثة إلى أربعة أيام. حصاد الكريات الخلية ثلاثة و 10 و 24 يوما بعد transfection لتحليل كفاءة تحرير قاعدة.

استخراج الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الجينومي. تصميم أول التمهيديات PCR لتضخيم مواقع BRCA1 المستهدفة. وعلى الرغم من عدم وجود قيود على حجم أول منتج من منتجات PCR، يوصى بحجم منتج يقل عن كيلوباسس واحد لتضخيم منطقة معينة بكفاءة.

تصميم التمهيدي PCR الثاني الموجود داخل المنتج PCR الأول، مع الأخذ في الاعتبار حجم amplicon وفقا لNGS طول القراءة. من أجل إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS، إضافة تسلسلات إضافية إلى 5'نهايات من التمهيدي PCR الثاني. تضخيم المواقع المستهدفة BRCA1 على الحمض النووي الجينومي التي تم الحصول عليها من النقاط الزمنية الثلاث باستخدام البوليميراز عالي الدقة.

بالنسبة لتفاعل PCR الأول، استخدم 100 نانوجرام من الحمض النووي الجينومي للتضخيم على مدى 15 دورة. بالنسبة لتفاعل PCR الثاني، استخدم ميكرولتر واحد من أول منتج PCR للتضخيم على مدى 20 دورة. تشغيل خمسة ميكروليترس من المنتج PCR الثاني على 2٪ agarose هلام وتأكيد حجم.

ثم إرفاق تسلسلات أساسية لتحليل NGS من خلال تضخيم المنتج PCR الثاني باستخدام التمهيديات المذكورة في مخطوطة النص. تضخيم كل عينة باستخدام مجموعات التمهيدي مختلفة. استخدم ميكرولتر واحد من المنتج PCR الثاني لمدة تصل إلى 30 دورة من التضخيم مع البوليميراز عالية الدقة.

تشغيل خمسة ميكرولترات من المنتج PCR على 2٪ agarose هلام لتأكيد حجم وتنقية amplicon باستخدام مجموعة تنظيف PCR التجارية. اخلط كل عينة بكميات متساوية لإنشاء مكتبة NGS. كمي مكتبة NGS باستخدام مقياس الطيفي وتمييعه إلى تركيز واحد نانوموللار باستخدام العازلة resuspension أو 10 ملليمولار تريس HCl في درجة ح H 8.5.

إعداد 100 ميكرولترات من المكتبة المخففة إلى تركيز التحميل المناسب. كتحكم يجمع PhiX مع العينة المخففة. قم بتحميل المكتبة على الكارتريدج و قم بتشغيل NGS وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

الحصول على أكثر من 10،000 يقرأ لكل أمبيركون الهدف لتحليل متعمق لكفاءة تحرير قاعدة. تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء تقييم وظيفي لمتغيرات BRCA1 الذاتية التي تم إنشاؤها بواسطة محررات قاعدة السيتوسين المستندة إلى CRISPR. تم نقل CAS-9 ودليل RNAs إلى خطوط خلايا HAP1 لتعطيل BRCA1 ، وتم تحليل ترددات الطفرات.

انخفضت ترددات الطفرات بشكل ملحوظ مع مرور الوقت في خطوط خلايا HAP1 ، مما يشير إلى أن BRCA1 هو جين أساسي لصلاحية الخلية في هذه الخلايا. للتحقيق فيما إذا كان CG إلى TA بدائل المتغيرات تؤثر على وظيفة BRCA1، وplsmids الحمض النووي ودليل الترميز RNAs التي يمكن أن تحفز كل طفرة كانت مصابة إلى خطوط الخلية HAP1-BE3. و تم تحليل ترددات الاستبدال

وانخفضت بشكل كبير ترددات الاستبدال النسبية من 3598C إلى T، وهو متغير مسبب للأمراض يحفز طفرة هراء. في حين أن تلك من 4527C إلى T، وهو البديل حميدة التي تحفز طفرة هراء، ظلت مماثلة مع مرور الوقت. وتبين أن ترددات استبدال النيوكليوتيدات لهذه المتغيرات الثلاثة قد انخفضت بطريقة تعتمد على الزمن.

وبما أنه من الضروري الحصول على تردد طفرة أولي مرتفع من أجل التعرف بوضوح على التغيير في قابلية الخلية للتطبيق مع مرور التاريخ ، فمن الأولوية إنشاء ظروف نقل محسنة. يمكن تطبيق هذا الإجراء للتحقق من المتغيرات الجينية الأخرى غير المعروفة مثل BRCA VUS. قد توفر أدلة على الإمراض من المتغيرات غير معروف المستمدة من المريض وعلاجهم.