فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

يستخدم بروتوكولنا مسابير الفلوروفور العادية وتقنيات إعداد العينات البسيطة التي تحافظ على الخلية المصورة في حالة فسيولوجية لدراسة العملية الخلوية الديناميكية للغاية والهياكل الخلوية الفرعية التفصيلية. تسمح لنا هذه التقنية بالتحقيق في العمليات الخلوية بدقة فائقة وفي ظل ظروف فسيولوجية لفترة طويلة دون التضحية بالدقة الخاصة أو المؤقتة. تبدأ بقطع 12 إلى 14 كيلودالتون الوزن الجزيئي قطع غشاء غسيل الكلى إلى قطع صغيرة ونقع القطع مع 100 ميكرولتر من متوسط الخلية الحية لمدة خمس دقائق تقريبا.

في حين يتم نقع الأغشية، وقطع الحلقة الخارجية من أنبوب 50 ملليلتر إلى قطع صغيرة وتعقيم القطع في الإيثانول 70٪. لتشريح الخصيتين وتصاعد، ونقل عشرة يومين إلى ثلاثة أيام من العمر الذباب الذكور تخدير في طبق تشريح تحت المجهر تشريح واستخدام ملقط غرامة لإزالة الخصيتين. عندما يتم جمع جميع الخصيتين، وغسل الخصيتين مرتين في المتوسط الخلية الحية واستخدام طرف ماصة لنشر 100 إلى 150 ميكرولتر من المتوسط الخلية الحية إلى الطبق السفلي الزجاج المعدة.

استخدام ملقط غرامة لنقل الخصية يطير إلى وسط الطبق وإزالة جميع ما عدا حوالي 10 ميكرولتر من المتوسط. بسرعة، ضع الغشاء الرطب قبل على الخصيتين ووضع اثنين إلى ثلاثة أوزان بلاستيكية صغيرة على الغشاء. على الفور، إضافة 100 إلى 150 ميكرولتر من الخلايا الحية الطازجة المتوسطة ووضع الخاتم مرة أخرى على الجانب مرتفعة من الطبق.

ضع الغطاء على الحلقة ودوامة قطعة من ورق الأنسجة في الماء قبل وضع الورق على زلة الغطاء. ثم، تغطية الطبق مع غطاء وتأمين الطبق على خشبة المسرح من المجهر فائقة الدقة. لتصوير الخلايا الجذعية الجرثومية، افتح برنامج التصوير ثم قم بتشغيل الضوء المرسل.

استخدم هدف 63X للتركيز على أنسجة الخصيتين و تشغيل الليزر. انقر فوق Live"لتحديد موقع الخلايا الجذعية الجرثومية. ضبط التركيز وانقر فوق حجم الإطار"لتعيين حجم الإطار إلى ما بين 512 في 512 و 1024 بواسطة 1024 بكسل، ومتوسط"لتعيين متوسط الإطار إلى واحد أو اثنين.

انقر فوق كسب رئيسي"لتعيين الإلكترون ضرب كسب إلى أقل من 800، والليزر"لتعيين قوة الليزر إلى 1٪إلى 2٪التكبير في المنطقة أو الخلية ذات الاهتمام للحد من وقت التقاط الصورة والحد من تبييض الصور، والتأكد من أن الصورة قد تم تكوينها على النحو الأمثل قبل النقر فوق بدء التجربة"لبدء التقاط صورة الفاصل الزمني. إذا لم يتم تكوين اقتناء Airyscan على النحو الأمثل"يتم عرض، انقر فوق الأمثل"في حجم الإطار، Z-المكدس، ومسح المنطقة"أقسام، وتحسين الفاصل الزمني، وعدد من شرائح Z ومدة التصوير الفاصل الزمني، وفقا للتصميم التجريبي ونوع العينة. بعد التصوير، حدد معالجة، دفعة"و Airyscan معالجة، وحدد الصور التي سيتم معالجتها.

ثم انقر فوق تشغيل عملية"للحصول على الصور فائقة الدقة. التصوير بالخلايا الحية من الخصيتين drosophila التعبير عن ألفا tubulin GFP في الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة باستخدام المجهر confocal القرص الغزل، ويسمح تصور كثافة غير متناظرة من إشارات GFP في اثنين من centrosomes، كإشارة أكثر إشراقا في المركزية الأم وإشارة أضعف نسبيا في سنتروسومات ابنة. من المرجح أن ينعكس الفرق في السطوع من خلال عدم التماثل الزمني لنوى microtubule ، ولكن لا يمكن حل مورفولوجيا مفصلة وكمية من microtubules باستخدام المجهر الغزل قرص confocal.

في المقابل ، يسمح التصوير الفائق للخلايا الحية بالتصور والتحديد الكمي لمورفولوجيا الخلايا الدقيقة والأرقام. ويكشف هذا القرار المحسن أيضا عن أنماط من نواة الميكروتبول غير المتماثلة، والاطالة، وزيادة التفاعل مع الغشاء النووي. يسمح تصوير الخلايا الحية أيضا بتصور تجويف الغشاء النووي غير المتماثل ، ولكن ليس للخلايا الدقيقة الفردية التي تدخل النواة مباشرة.

في المقابل ، تسمح تقنية الدقة الفائقة للخلايا الحية هذه بالملاحظة المباشرة لهذه الأحداث عن طريق التصوير المتزامن لكل من الخلايا الدقيقة والصفائح النووية. خلال ميتافيزي، يمكن الكشف عن كل من centromeres الشقيقة كإشارة واحدة باستخدام المجهر قرص الغزل، على الرغم من أن المرفق المركزي microtubule لا يمكن ملاحظتها. في المقابل ، يسمح التصوير الحي فائق الدقة بتصور مرفق ميكروتوبيول سنترومير في البروبوهاز المبكر.

تأكد من وضع غشاء فوق الخصية للتأكد من أنها لا تتحرك أو تطفو أثناء التصوير وتحسين إعدادات المجهر لتجنب تبييض الصور وسمية الصورة. هناك العديد من الطرق التي يمكن تطبيق هذه الطريقة، مثل التحقيق في ديناميات البروتين، والإجهاد الخطي، أو الدفاعات والعمليات الخلوية.