دينامية القياس والتصوير من الشعيرات الدموية، والشريين، و Pericytes في قلب الماوس

يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة دوران الأوعية الدقيقة التاجية في أنسجة قلب الفئران الحية ومكونات شجرة الأوعية الدموية عن طريق المراقبة خارج الجسم الحي لضغط التروية الشريانية وتدفقها. توفر هذه الطريقة منصة مفيدة لدراسة وظيفة الخلايا المحيطة والكواشف في دوران الأوعية الدقيقة داخل القلب ، لذلك نميل إلى قياس قطر الأوعية الدموية والضغط اللمعي الشرياني. لتحضير قنية للتجربة ، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لإنتاج قنية ذات أطراف رفيعة طويلة ، من أنبوب زجاجي واحد نظيف من البورسليكات.

استخدم مقصا دقيقا ومجهرا تشريحا لقطع طرف كل قنية إلى قطر طرف نهائي يتراوح من 100 إلى 150 ميكرومتر ، وقم بتلميع الأطراف لتقريب الحواف الحادة قليلا. استخدم سلكا بلاتينا موضوعا على جانب العمود ، على بعد ملليمترين تقريبا من الطرف لثني القنية على طول العمود بزاوية 45 درجة تقريبا ، وأدخل الطرف المفتوح للقنية في حامل القنية. بعد ذلك ، شد التركيب ، واستخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر لغسل القنية والأنابيب بمحلول Tyrode.

قم بتركيب حامل القنية على معالجة دقيقة لغرفة عضل الضغط. لجمع قلب فأر للتجربة ، أدخل أولا زوجا فيه ، وقم بحقن 500 ميكرولتر من الهيبارين في فأر مخدر يبلغ من العمر ثمانية إلى 16 أسبوعا من C 57 أسود ستة أسابيع. بعد 10 دقائق ، ضع الماوس على سرير ساخن في وضع الاستلقاء ، وقم بتثبيت الكفوف بشريط لاصق.

استخدم الملقط والمقص الجراحي لعمل شق في جلد البطن ، فوق الحجاب الحاجز وقطع الحجاب الحاجز والقص للسماح بتشريح القلب من التجويف الصدري. ضع القلب في محلول Tyrode المثلج الذي يحتوي على 30 ملليمولار BDM وقم بإزالة أي أنسجة ضامة من القلب حسب الضرورة. ثم ضع القلب في حجرة تشريح مبردة مسبقا ، مليئة بمحلول Tyrode الطازج المكمل ب 30 مللي مولار BDM.

لتحضير شريان الحاجز للقنية ، قم بتشغيل أبهة المؤازرة ، واضبط ضغط وحدة التحكم المؤازرة على وضع التدفق. في القلب على PDMS ، مع الحرص على تجنب تلف المنطقة الوسطى من الأنسجة ووضع الأنسجة تحت مجهر تشريح. قم بإزالة أحد الأذينين أو كليهما ، وافتح البطين الأيمن.

قم بإزالة جدار البطين الأيمن وكشف شريان الحاجز. استخدم خيط نايلون بقطر 30 ميكرومتر لربط عقدة فضفاضة حول شريان الحاجز. استخدم مقصا دقيقا لإزالة جدار البطين الأيسر الحر ونقل مستحضر العضلات الحليمية إلى الغرفة التجريبية.

استخدم مناور دقيق لإدخال قنية في شريان الحاجز وتأمين القنية بالخياطة. ثم استخدم المسامير لتثبيت العضلة الحليمية على أرضية الغرفة مع طرف القنية الموازي لجدار الشرايين ، بحيث يمكن الحصول على رؤية واضحة للأوعية الدموية واستخدام المحقنة لغسل المحلول تدريجيا من خلال القنية. لتثبيت تحضير الأنسجة ، قم بتشغيل مضخة تمعجية وقم بدمج المستحضر باستمرار بمحلول ملحي فسيولوجي مغطى بالغازات مسبقا بمعدل تدفق من ثلاثة إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة ، وقم بتشغيل جهاز التحكم في درجة الحرارة لمحلول الصهر الفائق ، واضبط درجة حرارة الصهر الفائق للحمام إلى 35 إلى 37 درجة مئوية.

قم بتوصيل القنية بالمضخة المؤازرة واضبط التدفق لضبط الضغط على حوالي 10 ملليمترات من الزئبق. دع الصخ الفائق يعمل لمدة 10 دقائق تقريبا ، ثم قم بزيادة تدفق المحلول اللمعي لضبط ضغط الشريان على حوالي 60 ملم من الزئبق والسماح للعينة بالاستقرار لمدة 30 إلى 60 دقيقة مع المراقبة. لتحميل العينة بالرص جنين القمح ، قم بتنقية المستحضر بخمسة ملليلتر من محلول Tyrode ، مع استكمال 100 ميكروغرام من Alexa Fluor-488 المترافق من جنين القمح Agglutinin.

بعد 30 دقيقة ، قم بتغيير مساعد التصويب مرة أخرى إلى محلول Tyrode العادي وقم بتشغيل نظام المجهر متحد البؤر. استخدم المجهر بقوة تكبير أقل ، لتحديد موقع شريان الحاجز في وضع الضوء المنقول ، وابدأ التصوير باستخدام هذا القرص الدوار الكونفوكل. حدد تكبير موضوعي 40X ، وليزر الإثارة 488 نانومتر ، واضبط شدة الليزر ومعدل أخذ العينات.

لتحديد نطاق التصوير، قم بتعيين مواضع التصوير العلوية والسفلية للمجهر وتعيين حجم الخطوة ومعلمات التصوير Z-stack. ثم حدد مجلدا لتخزين الصورة وانقر فوق تشغيل لبدء تسجيل الصور. عندما يتم نشر علامة الأوعية الدموية الفلورية في تجويف الأوعية الدموية ، فمن الممكن تصور أشجار الأوعية الدموية بأكملها ، باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر عالي السرعة.

يتيح التكبير الإضافي تصوير الشعيرات الدموية بالتفصيل. عندما يتم تقديم ناهض قناة البوتاسيوم الحساسة pinacidil و ATP من التجويف ، يزداد قطر الشرايين. عندما يتم تطبيق بطانة مضيق للأوعية من التجويف.

الشريان ينخفض. عندما تكون مجموعة التدفق ثابتة ، يزداد الضغط الضوئي. في هذه الصور للأنسجة الحليمية من فأر معدلا وراثيا باللون الأحمر NG two DS ، يمكن تصور كل من الشعيرات الدموية والفطرات داخل أنسجة العضلات الحليمية ، في ظل ظروف تحاكي بشكل أفضل فسيولوجيا الحية.

من المهم عدم وجود فقاعات داخل الأنبوب في أي وقت أثناء العملية. من خلال الجمع بين هذه الطريقة وتقنيات التصوير البصري ، يمكن استخدام المستحضر لدراسة دوران الأوعية الدقيقة في القلب والاتصالات بين الخلايا بين أنواع الخلايا المختلفة ، باستخدام الفئران المعدلة وراثيا بتقنية الفلورة.