القياس الكمي للحمض النووي الخاص بالخنزير في الدم لنموذج زراعة Xenotransplantation

Xenotransplantation هو وسيلة مجدية لعلاج ومع ذلك ، الرصد الفعال للرفض المناعي للxenotransplantation هو مشكلة للأطباء والباحثين. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة ومريحة ومنخفضة التكلفة وأقل الغازية لرصد رفض المناعة من xenotransmutation. ويمكن استخدام هذه التقنية في مجال زراعة النباتات، بما في ذلك زرع الجزر من الخنزير إلى الإنسان، وزرع الكلى، وزرع الكبد، وزرع القلب.

تبدأ عن طريق نقل 500 ميكرولترات من عينات الدم إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المختلفة. إضافة 20 ميكرولتررس من protease K و 500 ميكرولترات من عازلة تحلل في الأنابيب. ثم يهز لهم جيدا لخلط.

وضع الأنابيب في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تهز لهم مرتين إلى ثلاث مرات أثناء الحضانة حتى يصبح الحل الطرد المركزي واضحة لهم لفترة وجيزة لإزالة الخرز السائل من الجدار الداخلي لأغطية الأنبوب. ثم إضافة 500 ميكرولترات من اللامائية، الكحول الإيثيل، ويهز جيدا. نقل الخليط إلى عمود الامتزاز.

ثم الطرد المركزي العمود لمدة دقيقتين والتخلص من السائل النفايات. إضافة 800 ميكرولترات من محلول شطف لكل عمود الامتزاز، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. ترك الأعمدة في درجة حرارة الغرفة لبضع دقائق لتجفيف محلول الشطف المتبقي.

نقل أعمدة الامتصاص إلى أنبوب طردي مركزي نظيف. إضافة 50 ميكرولترات من عازلة elution إلى منتصف الأفلام الامتزاز ووضعها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، ثم الطرد المركزي لهم لمدة دقيقة واحدة. إعداد المزيج الرئيسي PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم إضافة 23 ميكرولترات من المزيج في كل أنبوب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 0.6 ملليلتر.

إضافة اثنين microliters من الحمض النووي الجينومي إلى كل أنبوب وكابوت بعناية. ثم مزيج لفترة وجيزة والطرد المركزي. ضع الأنابيب في دورة PCR وابدأ التضخيم.

عندما يتم الانتهاء من رد الفعل أداء Agarose الكهرباء. أضف 1.2 غرام من أغاروز في قارورة تحتوي على مائة ملليمتر من TAE واغليها لمدة خمس دقائق في الميكروويف. مرة واحدة وقد هدأت Agarose إلى ما يقرب من 70 درجة مئوية، إضافة خمسة ميكرولترات من صبغة حمض نووي في القارورة، ببطء، صب في لوحة وتركها في درجة حرارة الغرفة حتى يتجمد في هلام.

إضافة خمسة ميكرولترات من كل عينة وسلم الحمض النووي 2-Log أو علامة الحمض النووي 1، في آبار جل أغاروز والكهربية في 120 مليون رصيف حتى يتم فصل العصابات. تصور الجل مع التصوير فوق البنفسجي. بعد إجراء التحول كما هو موضح في مخطوطة النص، تحقق من البلازميدات بواسطة مضاعفة تقييد الهضم الإنزيم مع EcoR I و بام HI. فصل المنتجات المهضمة مع 1٪ Agarose electrophoresis وفضح الجل لضوء الأشعة فوق البنفسجية.

تمييع البلازميد المركز مع جزء من الحمض النووي porcine إلى مرتين 10 إلى 11th نسخ لكل ملليلتر للمحلول القياسي البداية، وذلك باستخدام الماء المقطر مزدوجة. لإنشاء منحنى قياسي، قم بإعداد مزيج رئيسي qPCR، كما هو موضح في مخطوطة النص وإضافة 40 ميكرولترات من المزيج في كل أنبوب من شريط ثمانية أنابيب. إضافة 10 ميكرولترات من الحمض النووي القياسية من تركيزات مختلفة، وغطاء الأنابيب ثم خلط لفترة وجيزة والطرد المركزي لهم.

ضع الأنابيب في جهاز qPCR واجري التضخيم. استخدام أنابيب EDTA لجمع عينات الدم من حوالي 400 ميكرولترات من نماذج التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد، أو 100 ميكرولترات من نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر. ثم نقل العينات إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر.

إزالة خلايا الدم من عينات الدم عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة منخفضة وسرعة عالية. نقل المُندفع إلى أنبوب جديد للطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر، ثم قم بإزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 16000 مرة من G لمدة 10 دقائق. نقل المابير إلى أنبوب جديد للطرد المركزي 1.5 ملليلتر واستخراج الحمض النووي المتداول باستخدام مصل تجاري أثناء تعميم عدة استخراج الحمض النووي.

تكثيف حجم الحمض النووي المتداول إلى 40 ميكرولترات وتخزينها في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية. تنفيذ qPCR لتحديد كمية الحمض النووي المتداولة الخاصة الخنزير. تم تصميم القرائية الخاصة ببورسين واستخدامها لتحديد الحمض النووي الخاص بخنزير الانتشار بواسطة qPCR ، في نماذج زرع الخلايا من الخنزير إلى الفأر وتصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد ، ونماذج الزرع.

تم استخدام الكهرباء Agarose لعزل شظايا الحمض النووي المضخمة. وباستخدام PCR، تم تحديد الـ التمهيدي الخاص بالحمض النووي الجينومي المسامي المكبر. بعد ذلك ، تم تأكيد خصوصيات الأنواع من هذه الزهية في مجموعة من القرد أو الحمض النووي الجينومي البشري أو في مجموعة الحمض النووي الجينومي للفأر.

وأخيرا اثنين من السلالات المحددة التمهيدية، واستخدمت لتضخيم الحمض النووي الخنزير في التصحيح الشريان من الخنزير إلى القرد والخين إلى الفأر، ونماذج زرع الخلايا. أهم شيء يجب تذكره أثناء محاولة هذا البروتوكول هو أنه يجب منع التلوث من جميع الأنواع. هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف أسئلة جديدة داخل زراعة xenotransation لأنها طريقة بسيطة منخفضة التكلفة وغير الغازية لرصد الرفض المناعي للxenotransplantation.