تمكين التعويض في الوقت الحقيقي في الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات لتحديد التغيرات في تضاريس البروتين

الطريقة يسهل قياس البروتين تأكيد والتفاعلات البروتين. التركيب العازلة، نقاء العينة ومتطلبات تركيز البروتين مرنة مما يسمح للطريقة لمعالجة المشاكل الهيكلية الصعبة. هذه التقنية تسمح ضغط العينات في مجموعة واسعة من أنظمة العازلة المختلفة.

باستخدام أسلوب قياس الجرعات لدينا، يمكن للباحثين مراقبة مدى نجاح ردود فعل العلامات الخاصة بهم في الوقت الحقيقي. أحد تطبيقات هذه التكنولوجيا هو في تطوير المخدرات لأنها تسمح للباحثين لاختبار تركيبات الأدوية المختلفة على نطاق واسع وكيف تؤثر على بنية البروتين. لإعداد مقاعد البدلاء البصرية FPOP.

أول بدوره على الليزر وتعيين الليزر إلى الزناد الخارجي، والطاقة المستمرة وعدم استبدال الغاز. عندما يكون الليزر قد دفأ تعيين طاقة الليزر لكل نبضة إلى ما بين 80 إلى 120 ملليغرام لكل نبضة واستخدام شعلة البوتان لحرق بلطف ترميز بوليميد من الشعرية في المكان الذي سوف يقرأ مقياس الجرعات مضمنة إشارة ماصة في 265 نانومتر بعد التعرض بالليزر. استخدم مسحًا وميثانولًا خاليًا من الوبر لمسح الحطام بلطف من الشعيرات الدموية ووضع الشعيرات الدموية النظيفة من خلال مسار شعاع الليزر وإلى مقياس الجرعات المضمن.

اضغط على ذراع في الجزء العلوي من مقياس الجرعات المضمن لفتح المفصلي وإزالة الاقطاب المغناطيسية. ضع الشعيرية في الأخدود الجهاز من الجرعات المضمّنة باستخدام حاملات المغناطيسية للحفاظ على الشعرية في مكانها وإغلاق المفصلي الجرعات فوق الشعرية التي تضغط على المفصل حتى أقفال الرافعة في مكانها. انقر فوق زر الفلاش البداية في برنامج قياس الجرعات لبدء إطلاق ليزر إكسيميمر وتعيين معدل التكرار المسبق بين 10 إلى 20 هيرتز في برنامج قياس الجرعات مع إطلاق الليزر يحرك المرحلة الآلية من خلال نطاق حركتها ، وضمان أن يبقى الشعاع مركزًا على الفتحة وأنه يمكن ملاحظة صورة ظلية من الشعيرات الدموية في جميع أنحاء.

ثم تدفق شعرية مع الماء في 20 ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة لمدة دقيقة واحدة على الأقل وانقر فوق البيانات بدء بالإضافة إلى السيارات صفر في برنامج مقياس الجرعات الصفر مقياس الجرعات إلى الماء قبل البدء في جمع البيانات. لتنفيذ تجربة FPOP إضافة اثنين microliters من بيروكسيد الهيدروجين إلى 18 ميكرولترات من محلول FPOP واستخدام ماصة لخلط بلطف الحل بسرعة جمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الطرد المركزي واستخدام حقنة الغاز ضيق على الفور لتحميل الحل في مضخة حقنة. انقر فوق بدء تشغيل المضخة وبدء البيانات في برنامج مقياس الجرعات لبدء التدفق على مضخة الحقنة بمعدل التدفق المناسب واستخدام مقياس الجرعات المضمن لمراقبة قراءة الأدينين في الوقت الحقيقي حتى تستقر إشارة ماصة عند 265 نانومتر في جمع العينة في حاوية نفايات.

لبدء اطلاق الليزر في سرعة سرعة التكرار مسبقا الطاقة انقر فوق زر فلاش بدء في البرنامج دوسيمتر واستخدام مقياس الجرعات المضمنة لمراقبة القراءة في الوقت الحقيقي adenine. الفرق في الامتصاص في 265 نانومتر مع الليزر قبالة والليزر على سيكون ماصة دلتا في 265 nanometers القراءة. لضمان أن تكون الجذور الهيدروكسيل قابلة للمقارنة متاحة للتفاعل مع البروتينات عبر عينات مختلفة.

قارن ماصة دلتا في 265 nanometer القراءة التي تم الحصول عليها مع دوسيمتر مضمنة مع ماصة دلتا الرغبة في 265 nanometers القراءة التي تم الحصول عليها من التجارب السابقة أو عناصر التحكم. إذا كانت القراءة في المستوى المطلوب جمع العينة مباشرة بعد الليزر أو الإشعاع في المخزن المؤقت لإخماد. لتعويض الجرعة الراديكالية الفعالة لمعادلة قراءات الامتصاص تغيير تركيز بيروكسيد الهيدروجين، تغيير الطاقة الليزر لكل نبضة أو تغيير الطائرة المحورية للعدسة التركيز لزيادة فلونس الليزر.

لجعل أكبر من 10 ملليمتر وحدة امتصاص التغيير في دلتا ماصة قراءة إعادة تشكيل العينة مع بيروكسيد الهيدروجين أكثر أو أقل وإعادة تشغيل العينة كما هو موضح. لإجراء تغيير صغير في القراءة امتصاص في الوقت الحقيقي، واستخدام المرحلة 50 ملليمتر الآلية لضبط موقف العدسة التركيز لضبط الطائرة البؤرية لشعاع الحادث. لقياس الكمية الفعالة من الهيدروكسيل الراديكالية الموجودة في العينة بعد أشعة الليزر رصد ماصة دلتا أدينين في 265 نانومتر في الوقت الحقيقي مع كاشف الشعيرات الدموية للأشعة فوق البنفسجية مضمنة باستخدام المرحلة الآلية لضبط موقف العدسة حتى ماصة الدلتا في 265 نانومتر القراءة يساوي القراءة المطلوبة.

المقارنة بين البصمة الببتيد سلسلة الثقيلة من التدليل biosimilar في العازلة الفوسفات وبعد التدفئة في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة يكشف عن أن المناطق الببتيد المشار إليها تظهر حماية كبيرة من المذيبات عندما يتم تسخين البروتين لتشكيل المجاميع. إن استخدام مقياس الجرعات المضمن في الوقت الحقيقي لرصد الفرق في ماصة الأدينين قبل وبعد الليزر أو الإشعاع يشير إلى أن هناك تغيراً مماثلاً في مستوى امتصاصات الأدينين لوحظ في حاجز MES مقارنةً بالمخزن المؤقت للفوسفات. في حين أن متوسط أكسدة الببتيدات أقل في وجود حاجز MES مقارنة مع عازلة الفوسفات.

ومع ذلك، كما يتم زيادة فلونس الليزر أن يكون لها استجابة قياس الجرعات عدنين على قدم المساواة متوسط قيم أكسدة الببتيد هي نفسها تقريبا بعد FPOP ومخزن ميث العازلة والفوسفات العازلة. كما تتأثر القراءة قياس الجرعات من تركيز بيروكسيد الفلورس بالليزر وكذلك زبال الراديكالية. خذ العناية بأن استجابة قياس الجرعات بين عينة المسح قريبة من بعضها البعض.

غالباً ما يستخدم الموقع الطفرات الموجهة للتحقيق في المواقع المحمية في FPOP. وهذا يسمح للباحثين لتحديد ما إذا كانت التغييرات بسبب أليستر. هذه التقنية تسهل مقارنة البروتينات في المخازن المؤقتة المختلفة أو التركيبات التي تسمح للباحثين بتحديد تأثير الإضافات المختلفة على تأكيد البروتين.