تحضير وإدارة وتقييم الامتصاص الخلوي الخاص بالأنسجة الحية للجسيمات الشحمية الفلورية ذات العلامات الصبغية

يجمع بروتوكولنا بين طريقة يمكن الوصول إليها لإعداد الجسيمات الشحمية المحملة ب tesaglitazar مع نهج شامل لتقييم امتصاص الجسيمات الشحمية على المستوى الخلوي. توفر هذه التقنية طريقة غير متحيزة لتقييم امتصاص الجسيمات الشحمية ذات العلامات الفلورية التي يتم تحضيرها باستخدام درجات حرارة منخفضة وسهلة الحصول على المعدات. لإعداد الجسيمات الشحمية ذات العلامات الفلورية المحملة بخلات الكالسيوم و tesaglitazar ، استخدم أولا مسبارا نصف بوصة لاستحلاب محلول كلوروفورم الأثير من الدهون عن طريق الصوتنة لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ، و 20 كيلو هرتز ، و 50٪ من الطاقة.

انقل محلول مستحلب الماء والزيت المتجانس على الفور إلى مبخر دوار باستخدام محول خاص ومقياس نانومتر وصمام منظم ضغط وقم بتوصيل المبخر بخط تفريغ. لإزالة المذيبات العضوية ، اضبط معدل الدوران على 100 دورة في الدقيقة والفراغ على 0.5 غلاف جوي. بعد أن يتشكل الجل ويختفي ، قم بزيادة الفراغ إلى 0.9 غلاف جوي وقم بتصفية التشتت المائي للجسيمات الشحمية ذهابا وإيابا من خلال مرشح بولي كربونات صب 200 نانومتر في آلة بثق الجسيمات الشحمية المجهزة بحقنتين محكمتين للغاز عدة مرات.

بعد التحقق من توزيع الحجم عن طريق تشتت الضوء الديناميكي ، استخدم عمود دوران ملليلتر لإزالة أي تيساغليتازار غير محاصر من الجسيمات الشحمية واستخدم مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الدواء المحبوس. ثم لا تضيف أكثر من 500 ميكرولتر من عينة الجسيمات الشحمية إلى سرير هلام العمود الجاف. لإدارة الجسيمات الشحمية عن طريق الحقن الرجعي الحجاجي ، اضغط برفق على الجلد أعلى وأسفل العين المكشوفة لرفع العين فوق مستوى الوجه.

ثم أدخل بعناية طرف الإبرة في الزاوية الأمامية من العين ، وتأكد من أن الإبرة أسفل الجرم السماوي دون لمسها ، وقم بحقن الجسيمات الشحمية ببطء في الفضاء المداري الرجعي. لحصاد عينة الدم ، عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، قم بعمل شق بعناية في الجلد على حافة الطرف الذيلي للقفص الصدري للفأر وقم بقطع خط مستقيم بطول سنتيمتر واحد باتجاه رأس حتى تتعرض عضلات الصدر. في موقع الشق الأولي ، قم بعمل قطعتين صغيرتين عموديا على الخط باتجاه الرأس وقم بقطع العضلة الصدرية بعناية على جانب واحد من القفص الصدري في المنطقة المكشوفة للسماح بالوصول بشكل أفضل إلى موقع إدخال الإبرة وتصوره.

أدخل الإبرة بين الضلعين الثالث والرابع مع إبقائها قريبة من الخط المركزي للقفص الصدري قدر الإمكان ، واسحب المحقنة برفق لبدء جمع الدم. عندما يتم جمع أكبر قدر ممكن من الحجم ، انقل الدم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 10 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA على الجليد. لاستخراج وسادة ما بعد الأنسجة الأربية من كل جانب من جوانب الفأر ، استخدم مجموعة واحدة من الملقط لتثبيت الغشاء البريتوني على الجانب الأيمن والمجموعة الثانية من الملقط لتثبيت حافة الجلد فوق الغشاء البريتوني من جهة أخرى.

اسحب الجلد برفق بعيدا عن الغشاء لفصل الطبقات عن بعضها البعض. قم بتثبيت الحافة الخارجية للجلد للوصول بشكل أفضل إلى مستودع الدهون وتحديد موقع مستودع الأنسجة الدهنية الإربي على طول الجلد. وحدد موقع العقدة الليمفاوية الأربية في وسط مستودع الدهون باستخدام الملقط والمقص لإزالة العقدة الليمفاوية حسب الحاجة.

بعد إزالة العقدة الليمفاوية ، استخدم الملقط للإمساك بعناية بنهاية المستودع الدهني الأقرب إلى النقطة المثبتة والبدء في عمل جروح صغيرة في الغشاء الضام بين الأنسجة الدهنية والجلد. ارفع الأنسجة الدهنية بعيدا عن الجلد أثناء عمل جروح للوصول بشكل أفضل إلى الغشاء ، وضع المستودع في قارورة بولي إيثيلين تحتوي على عازلة HEPES على الجليد. لاستخراج المستودعات الدهنية البربخية من الطرف الذيلي للتجويف البريتوني ، استخدم الملقط لسحب أول مستودع دهني للبربخ برفق من الطرف الظهري للفأر وتحديد موقع البربخ والأسهر المرتبط بهذا المستودع.

ثم قم بقص بعناية بين مستودع الدهون والبربخ والأسهر لفصل الدهون عن الأنسجة الأخرى ووضع الديبو في قارورة بولي إيثيلين مع عازلة HEPES على الجليد. عندما يتم حصاد جميع الأنسجة ، استخدم زوجا أو زوجين من المقص لفرم عينات الأنسجة الدهنية إلى شظايا أنسجة 0.5 ملم. بعد ذلك ، أضف 1.5 مل من ملليغرامين لكل مليلتر من الكولاجيناز إلى قوارير قطع الأنسجة الدهنية وضع القوارير في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 إلى 45 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لترثب العينات عدة مرات. إذا كانت قطع المناديل لا تزال كبيرة جدا بحيث لا يمكن سحب العينة بسهولة، فأعد العينات إلى الحاضنة لمدة 15 دقيقة إضافية. بمجرد هضم العينات بالكامل ، قم بترتيشر الأجزاء 10 مرات أخرى لضمان إنشاء معلق خلية واحدة وقم بتصفية كل عينة من خلال مرشحات فردية 70 ميكرومتر في أنبوب واحد سعة 50 مليلتر لكل عينة.

اشطف كل ملف بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS لجمع أي خلايا متبقية وتصفية كل غسلة في القارورة المناسبة لعينة الخلية على الثلج. عندما يتم تصفية جميع العينات ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وشفط الخلايا الشحمية من العينات. بعد ذلك ، قم بشفط المواد الطافية بعناية مع ترك كريات الكسر الوعائي اللحمي سليمة ، وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت FACS لكل أنبوب.

ثم انقل المعلقات إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 أو 1.7 ملليلتر على الجليد حتى تحليل قياس التدفق الخلوي بواسطة البروتوكولات القياسية. يكشف تشتت الضوء الديناميكي عن متوسط قطر الجسيم الشحمي البالغ 163.2 نانومتر وإمكانات زيتا تبلغ 19.2 مللي فولت تحت الصفر. يكشف التصوير المجهري الإلكتروني المبرد عن الجسيمات الشحمية الدائرية ذات الانحراف المعياري الصغير نسبيا التي تم الحصول عليها من متوسط القطر كما تم قياسه بواسطة تشتت الضوء الديناميكي.

يمكن استخدام تحليل قياس التدفق الخلوي للعينات من الفئران المعالجة ب PBS كمضان DiD مطروحا منه عنصر تحكم واحد لإنشاء بوابات موجبة DiD. كما هو موضح في هذا التحليل التمثيلي ، فإن تركيز تحميل الجسيمات الشحمية البالغ 10 ملليغرام لكل مليلتر من DiD مرتفع للغاية ، متجاوزا النطاق القابل للقياس الكمي لمقياس الخلايا في جميع الأنسجة الثلاثة التي تم اختبارها. يوضح تركيز 0.1 ملليغرام لكل مليلتر بعض الإشارات ، ولكن لا يلاحظ وجود مجموعة واضحة خارج الخلايا المعالجة ب PBS.

لذلك ، يوصى باستخدام تركيز واحد مليغرام لكل مليلتر ، والذي يوضح تمييزا واضحا عن التحكم في PBS بينما لا يزال محللا قابلا للقراءة بواسطة المحلل ، في تحضير الجسيمات الشحمية. مطلوب استراتيجيات بوابات مختلفة قليلا لكل نوع من أنواع الأنسجة ، ولكن يمكن تحديد معظم أنواع الخلايا نفسها في كل منها. بمجرد تحديد مجموعات سكانية محددة ذات أهمية ، يمكن تحديد الحجم الإجمالي لكل مجموعة خلية وتكرار إيجابية DiD.

إعداد الكواشف والمعدات وتوقع النتائج لكل خطوة أمرا بالغ الأهمية. قد تؤدي النتائج غير المتوقعة في وقت مبكر إلى تدمير النتائج المستقبلية. يمكن استخدام الطرق النسيجية لتقييم توطين الجسيمات الشحمية داخل الأنسجة بأكملها ، بينما يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي للتحقق من استيعاب الجسيمات الشحمية على أساس كل خلية.