Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

يتيح هذا البروتوكول الحصول المتزامن على أجنة متعددة في جلسة تصوير واحدة. في حين يتم تكييف إعداد العينة للحصول على نقاط متعددة باستخدام محلل محتوى عالي ، يمكن تصوير العينات المعدة باستخدام هذا البروتوكول على أي مجهر مقلوب قادر على الحصول على نقاط متعددة. للبدء، تنظيم صفين من 15 إلى 20 أجنة على قسم نظيف من لوحة كبيرة باستخدام أداة منتقي البيض.

محاذاة الأجنة على الجانب البطني في نفس التوجه فيما يتعلق بالغايات الأمامية والخلفية. الانضمام إلى المسافة على غطاء وشرائط 10 ميكرولترات من الغراء heptane أسفل الزجاج غطاء مكشوف inset. في حين يجف الغراء، واستخدام شفرة حلاقة لقطع مستطيل حول صفين من الأجنة.

قطع مستطيل الثاني بجوار الأول وإزالة المستطيل الثاني مع جانب حافة مستقيمة من ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ. حرك بعناية الحافة المستقيمة للمُسَقَق تحت المستطيل الأول وأزاله. ثم، ضع القطع مع الأجنة على الجانب الخارجي من طبق 3.5 سنتيمتر.

تحت مجهر ستيريو، خفض غطاء المعدة على الأجنة واضغط بلطف على صفين من الأجنة على الغراء. إذا لم يكن أداء الحقن المجهري، وملء الفضاء سيليكون في منتصف الطريق إلى أعلى مع واحد إلى واحد زيت الهالكربون 700 إلى زيت الهالوكربون 27. خط الحواف السفلية لمحول لوحة ذات أربعة شرائح مع شريط مزدوج الوجه.

سيمنع هذا الشريحة من الحركة أثناء التصوير. ضمان عدم وضع الشريط في مسار العدسة الهدف. قم بتحميل الغطاء على محول لوحة الشرائح الأربعة.

إذا microinjecting الأجنة، ووضع غطاء مع الأجنة على شريحة لمنع الجزء السفلي من غطاء من أن تصبح قذرة أثناء الجفاف والضنجن الدقيق. قم بـ دق الأجنة لمدة خمس إلى عشر دقائق، ثم تغطيها على الفور بزيت الهالكربون واحد إلى واحد 700 إلى زيت الهالكربون 27، وملء مساحة السيليكون في منتصف الطريق إلى الأعلى. قم بتحميل إبرين أو ثلاثة حقنة صغيرة مع ما يقرب من اثنين من الحقن باستخدام طرف تحميل ممتد.

جبل إبرة على الحقن المجهري والاكتئاب المكبس في منتصف الطريق إلى طرف، وزيادة ضغط الهواء داخل الشعيرات الدموية الزجاجية. خفض إبرة الزجاج على شريحة زجاجية وقطع غيض من إبرة مع شفرة حلاقة رقم 9 جديدة، وقطع في زاوية 45 درجة لإنتاج طرف مفتوحة حادة. يجب أن تتدفق الحقنة إلى أسفل الطرف دون أن تتدفق من الإبرة.

إضافة بعناية 20 ميكرولترات من زيت الهالوكربون على طرف الإبرة وإعادة قطع فتحه في زاوية 45 درجة. يجب أن يبدأ حقن في التدفق بسرعة، لذلك تذكر لضبط الضغط عن طريق سحب المكبس. استخدام micromanipulator لوضع الإبرة في وسط مجال الرؤية.

ثم ارفع الإبرة وأزل الشريحة الزجاجية من تحتها. ضع الأجنة على مرحلة المجهر الاستريو، تحت إبرة الحقن المجهري والتركيز عليها عند التكبير 50 مرة. خفض الإبرة حتى يأتي في نفس الطائرة التركيز مثل الأجنة.

تحريك الشريحة بيد واحدة وتشغيل الحقن المجهري مع الآخر، حقن صف واحد من الأجنة. رفع الإبرة وتدوير الشريحة 180 درجة لفضح الصف الثاني من الأجنة لإبرة الحقن المجهري. خفض الإبرة وحقن الصف الثاني من الأجنة.

وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة دور microtubules في إعادة تنظيم التشنج endoplasmic خلال الانقسام في الجنين Drosophila. تم مقارنة آثار العديد من العلاجات الدوائية الدقيقة على إعادة تنظيم ER كمياً. كولشيسين، الذي يمنع البلمرة microtubule جديدة، ووجد للحد بشكل كبير من توطين ER إلى قطبي المغزل خلال الانقسام.

تم الحصول على بيانات التصوير الفاصل الزمني لـ 32 جنينًا. تم تحليل القياسات كثافة الحد الأقصى والأقصى من 12، 800 المناطق ذات الاهتمام باستخدام سيناريو MATLAB مخصص. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، تذكر ألا تأخذ وقتاً طويلاً في أي خطوة واحدة، وإلا فإنك تخاطر بفقدان مرحلة التطوير التي تريد تصويرها.

ممارسة هذا البروتوكول خطوة بخطوة قبل محاولة أي تجارب. طريقة إعداد العينة لدينا تسهل الحصول المتزامن على أجنة متعددة خلال تجربة واحدة، وبالتالي توليد ما يكفي من التكرار التجريبي للتحليل الكمي. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الانتقال من تجارب علم الأجنة في النمو من تجارب التصوير النوعي إلى الكمي.

القدرة على صورة أجنة متعددة في جلسة تصوير واحدة يزيل أيضا الضوضاء التجريبية بين النسخ المتماثلة.