بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بالتعديل الجيني للنمط المصلي الذي لم يكن قابلا للتتبع سابقا ، مما يجعل من الممكن البحث وفهم النمط المصلي. هذا يفتح السبل للعمل البيولوجي مثل تطوير اللقاحات. ستظهر الإجراء فانيسا إس تيرا ، الأستاذة المساعدة من كلية لندن للصحة والطب الاستوائي.

للبدء في إنشاء البلازميد pSD1 عن طريق إجراء ربط باتباع تعليمات الشركة المصنعة ل pGEM-T Easy System I. احتضان التفاعل بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بتحويل الإشريكية القولونية Dh5-alpha ذات الكفاءة الكيميائية مع pSD1 ، واحتضان 50 ميكرولترا من الخلايا بثلاثة ميكرولترات من تفاعل ربط pSD1 لمدة 15 دقيقة على الجليد ، ثم قم بتعريض الخلايا لصدمة حرارية ووضع الخلايا على الجليد لمدة دقيقتين.

قم بإزالة الخلايا من الجليد وأضف 350 ميكرولترا من وسائط SOC ثم احتضان المزرعة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة. قم بلوحة التحول على Luria-Bertani agar مع 0.4 ملليمولار IPTG ، و 0.24 ملليغرام لكل مليلتر X-Gal للاختيار الأزرق والأبيض ، و 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين لضمان أن جميع المستعمرات التي تنمو على اللوحة تحتوي على العمود الفقري البلازميد. اختر ثلاث مستعمرات بيضاء تحتوي على pSD1 وقم بإعداد نمو بين عشية وضحاها في 10 ملليلتر من L-B مكمل ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين.

احتضان الثقافات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للثقافات عند 3 ، 082 جم واستخدم الحبيبات لاستخراج البلازميد. بعد استخراج الحمض النووي للبلازميد ، قم بإعداد هضم تقييد BamH1 لكل من بلازميد pSD1 وكاستيت سبيكتينومايسين.

احتضان تفاعلات الهضم المقيدة والتحكم عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. عند الانتهاء من التقييد ، قم بتحليل المنتجات عن طريق الرحلان الكهربائي ثم استئصال النطاق الصحيح وتنقيته باستخدام مجموعة تجارية. بعد ذلك ، قم بتشغيل تفاعل ربط باستخدام pSD1 المهضوم BamH1 و spectinomycin.

سيؤدي هذا إلى إنشاء البلازميد pSD2. قم بتحويل pSD2 إلى بكتريا قولونية DH5-alpha ذات كفاءة كيميائية كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، حدد المحولات التي تحمل البلازميد pSD2 بناء على قدرتها على النمو في LBA مكملة ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من سبيكتينومايسين وأمبيسلين واستخراج الحمض النووي البلازميد.

قم بإعداد استزراع المكورات الرئوية 519/43 طوال الليل في BHI واتركه ينمو بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الثقافات 1:50 و 1:100 في 10 ملليلتر من مرق BHI الطازج. احتضان الثقافة بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية حتى يصبح OD عند 595 نانومتر بين 0.05 و 0.1.

بمجرد الوصول إلى OD المناسب ، خذ 860 ميكرولتر من الثقافة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف 100 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 100 ملليمولار ، و 10 ميكرولتر من 20٪ BSA ، و 10 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 100 ملليمولار ، و 2 ميكرولتر من 50 نانوغرام لكل مليلتر CSP1 و 500 نانوغرام من pSD2. احتضان التفاعل بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك ، قم بوضع 330 ميكرولتر على ألواح أجار الدم بنسبة 5٪ مع 100 ميكروغرام لكل مليلتر من سبيكتينومايسين كل ساعة على مدى فترة حضانة مدتها ثلاث ساعات. بعد ذلك ، احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع مستعمرات مقاومة للسبيكتينومايسين على صفيحة أخرى من أجار الدم مكملة ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من سبيكتينومايسين وعلى ألواح أجار الدم المكملة ب 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين، والتي تختبر وجود العمود الفقري البلازميد.

احتضن كلتا المجموعتين من الأطباق بين عشية وضحاها. تم تأكيد التجميع الصحيح ل pSD2 عن طريق تقييد الهضم. ثم تم استخدام pSD2 لتحويل 519.43 خلية من النوع البري.

اعتبرت المستعمرات التي تنمو على سبيكتينومايسين بعد حضانة ليلية محولات إيجابية. تم إجراء تأكيد النمط الظاهري لطفرة الانحلال الرئوي من خلال تقييم نشاط انحلال الدم ل D39 ، 519/43 من النوع البري ، وطبقة دلتا المتحولة 519/43. تمت مقارنة هذا بانحلال خلايا الدم الحمراء بنسبة 0.5٪ صابونين ، والذي يعتبر 100٪ فقد المتحور قدرته على تحلل خلايا الدم الحمراء.

تم تأكيد جميع المستعمرات الإيجابية عن طريق التسلسل لتقييم موقع الإدخال. تم استخدام الاشعال ذات مواقع الربط خارج منطقة التماثل. عند إجراء تفاعل التحويل ، من المهم إضافة الكواشف بالترتيب الصحيح.