تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

يمكن استخدام هذه الطريقة للتقييم الكمي لنضوج الساركومير في عضلة القلب المشتقة من iPSC. باستخدام هذا النهج القائم على القرار الفائق ، من الممكن الكشف عن حتى تغييرات خفية في منظمة الساروميري ، وهو أمر غير ممكن مع التصوير confocal التقليدية. قبل الاستخدام بثلاث ساعات على الأقل، قم بتشغيل المجهر وجلب العينة إلى درجة حرارة الغرفة.

عندما يكون المجهر جاهزًا، أضف 300 ميكرولترات من مخزن تصوير PALM إلى بئر من الخلايا المسماة وأدخل الشريحة في الحجرة في حامل المرحلة من المجهر. حدد هدف زيت NA 1.57 100X واستخدم وضع PALM في برنامج التصوير وقم بتنشيط إعدادات TIRF. تعيين عدد من الإطارات إلى 5، 000 إلى 10، 000، وقوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية إلى 0.1٪، 647 ليزر إلى 0.2٪ ومستوى كسب إلى 50 إلى 100.

عند تعيين كافة معلمات الاستحواذ، قم بالتبديل إلى إضاءة الليزر وحدد خلية الهدف. للحصول على صورة، قم بزيادة قوة الليزر 647 إلى 100٪، وتقليل المكاسب إلى الصفر. قم بتبييض الخلية الهدف لمدة خمس ثوانٍ تقريباً، ثم قم بزيادة الكسب إلى 50 ثم بدء عملية الحصول على صورة PALM.

لإعادة بناء بيانات PALM ، في نهاية عملية الاستحواذ ، افتح البيانات في ImageJ وافتح المكون الإضافي لـ "عاصفة رعدية". حدد تحليل التشغيل في البرنامج المساعد وفتح قائمة إعداد الكاميرا. أدخل حجم البيكسل والكسب الكهرومغناطيسي.

في القائمة تحليل تشغيل، تعيين ترتيب B-spline إلى ثلاثة، مقياس B-spline إلى اثنين، عتبة شدة الذروة إلى stfwave. f1، نصف القطر المناسب إلى ثلاثة، سيجما الأولي إلى 1.6، التكبير إلى خمسة، تردد التحديث إلى 50، و shifts الجانبي إلى اثنين، وانقر فوق موافق. بعد إعادة الإعمار، حدد سيجما في قائمة الرسم البياني مؤامرة واستخدام أداة المستطيل لتحديد منطقة من الفائدة، باستثناء التحف المحتملة. إضافة المنطقة ذات الأهمية إلى عامل التصفية وإضافة وعدم اليقين أقل من 25 إلى منطقة قيم الفائدة.

في علامة التبويب إزالة التكرارات، أدخل عتبة مسافة 10 نانومتر. في علامة التبويب دمج تعيين المسافة القصوى إلى 20، الحد الأقصى للإطارات لكل جزيء إلى صفر، والحد الأقصى إيقاف الإطارات إلى واحد. في علامة التبويب تصحيح الانجراف، حدد الارتباط المتبادل وقم بتعيين عدد الصناديق والتكبير إلى خمسة، ثم احفظ صورة PALM النهائية ثم تصدير بيانات ما بعد المعالجة.

لتحليل طول الساركومير، قم باستيراد صورة PALM المعاد بناؤها ذات الأهمية في ImageJ واستخدم أداة الخط لرسم خط بين بنيات الساركومير المحددة عموديًا على القرص Z لقياس أقصر مسافة بين خيوط الأكمنة. في قائمة التحليل، حدد ملف رسم الرسم واكتسب الطول بين القمتين. لتحليل سمك القرص Z، قم بتحويل صورة PALM المعاد بناؤها إلى صورة وضع ثمانية بتات وفتح المكوّن الإضافي للكشف عن Ridge.

تعيين عرض الخط إلى 20، التباين العالي إلى 230، التباين المنخفض إلى 10، سيجما إلى 0.79، العتبة الأدنى إلى 25.84، والحد الأدنى لطول الخط إلى 20. حدد عرض التقدير، وتوسيع الخط، وعرض النتائج، ثم انقر فوق موافق واستخدم متوسط عرض الخط من جدول النتائج لمزيد من التحليل. تظهر خلايا القلب والوليد الجذعية المشتقة من iPSC نمطًا مماثلًا من نوع ألفا أكتينين مع هياكل ساركومير غير منتظمة.

التقييم الكمي يدل على أن طول وسمك خيوط أكتينين ألفا متطابقة تقريبا بين مجموعتين من الخلايا مما يدل على حالة نمو سابقة لأوانها من القلب المشتقة من iPSC. في المقابل، يعرض القلب الناضج البالغ شبكة ساركوميري عادية مع زيادة طفيفة في طول الساركومير وانخفاض سمك القرص Z. المقارنة بين التصوير confocal التقليدية و بالم يكشف عن أي فرق كبير في طول الساركومير.

ومع ذلك، يتم الكشف عن عمق انخفاض سمك القرص Z عندما تتعرض أجهزة القلب iPSC للتصوير بالم. يتم ملاحظة مكسب في القرار عند تطبيق PALM، والذي يتم دعمه من قبل مخططات كثافة المقابلة. ومن الجدير بالذكر أن هياكل الساركومير التي تم الحصول عليها باستخدام مخزن عازل منخفض الجودة يبدو أكثر سمكًا مقارنة بالهياكل التي يتم التقاطها في ظروف التصوير المثلى.

ويرجع هذا النقص في دقة البيانات إلى انخفاض خصائص الوميض للفلوروفور، مما يؤدي إلى عدد أقل من الفوتونات المكتشفة لكل حدث تعريب. وعلاوة على ذلك، يتم تقليل دقة التعريب، مما يقلل من الدقة الكلية لصورة PALM التي أعيد بناؤها. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر الانجراف عينة توطين دقيقة من الجزيئات الفلورية مما يؤدي إلى صور ضبابية.

للحصول على صور PALM المناسبة، من المهم جداً السماح بالتكرار الحراري لنظام التصوير بأكمله لتجنب الانجراف المفرط للعينة أثناء التصوير. بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير الهياكل الخلوية الأخرى مثل الميتوكوندريا بالم للحصول على معلمات إضافية لنضوج القلب.