توليد مكتبات الإدراج Transposon في البكتيريا السلبية الغرامية لتسلسل عالي الإنتاجية

هذه الطريقة مهمة لأنه يمكن استخدامها في الأنواع البكتيرية المتنوعة لتحديد الجينات الأساسية، جينات مقاومة المضادات الحيوية والجينات الهامة في اللياقة البدنية في أثناء العدوى. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التشارك الميكانيكي للحمض النووي الجينومي وطبعة بولي-CTL، والتي تقضي على الحاجة إلى إنزيمات تقييد باهظة الثمن، وإشعاع محول وتنقية هلام. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الالتهابات البكتيرية الإشكالية ، لأن الجينات التي تم تحديدها على أنها مهمة للعدوى أو مقاومة المضادات الحيوية ، يمكن أن تكون بمثابة أهداف للعلاجات الجديدة المضادة للميكروبات.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على النمط الجيني المعقد ، والعلاقات الظاهرية عبر الأنواع البكتيرية السالبة للجرام وإيجابية الجرام ، وتحسين فهمنا الحالي للوراثة البكتيرية. للبدء، نقل الثقافات بين عشية وضحاها إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر، و بيليه كل من الثقافات المتلقي والمتبرع باستخدام الطرد المركزي في 5، 000 مرات G لمدة 7 دقائق. تجاهل المُندفع.

استخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لإعادة تعليق بيليه سلالة المانحة في 4.5 ملليلتر من LB تكملها حمض ديامينوبيميليك. نقل سلالة المانحين التي أعيد تعليقها إلى أنبوب السلالة المتلقي. وعلى الفور توزيع تعليق التزاوج كما قطرات 100 ميكرولتر الفردية على لوحات LB agar، تستكمل مع حمض ديامينوبيميكي تحتضن لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ثم، نقل بعناية لوحات إلى في حاضنة 37 درجة مئوية والسماح للثقافات أن تتزاوج لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة إضافة 1.5 ملليلتر من LB على كل لوحة وحصاد البكتيريا في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا تزاوج باستخدام الطرد المركزي في 5، 000 مرات G لمدة سبع دقائق.

ثم, تجاهل افراط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من LB, لإزالة حمض ديامينوميليك المتبقية بيليه الخلايا مرة أخرى, وتكرار غسل مع LB. عند الانتهاء من استخدام ماصة مصلية ملليلتر 10 لتر لإعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من LB, تكمل مع 25٪ الجلسرين. نشر الخلايا على لوحات، وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم، احتضان لوحات في 37 درجة مئوية، بين عشية وضحاها.

إنشاء aliquots ملليلتر واحد من البكتيريا المتبقية وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. صب aliquot من التزاوج المجمدة على الجليد. ثم، استخدام حبات الزجاج المعقمة لنشر 150 ميكرولترات من التخفيف، على كل 30 من 150 ملليمتر لوريا-بيرتاني agar لوحة، تكمل مع Kanamycin.

تخلص من الأنبوب المستخدم الذي يحتوي على تزاوج زائد، ولوحات حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة. بعد الاحتضان عد وحدات تشكيل مستعمرة على كل لوحة لتقدير مجموع المسوخ في مكتبة transposon. عد 20٪ من ثلاث لوحات على الأقل لتحديد تقدير عدد المستعمرات لمجموعة كاملة من اللوحات.

بعد حساب العائد المقدر للمستعمرة، أضف من 3 إلى 5 ملليلتر من LB إلى كل لوحة، وكشط من البكتيريا باستخدام أداة كشط معقمة. سحب التعليقات البكتيرية من جميع لوحات في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر، بيليه تعليق عن طريق الطرد المركزي في 5، 000 مرات G، لمدة سبع دقائق. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من LB, تكمل مع 30٪ الجلسرين.

ثم, جعل aliquots ملليلتر واحد من مكتبة transposon في اكرفيات وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. تمييع gDNA مع TE العازلة إلى تركيز 250 نانوغرام لكل ميكرولتر، في حجم إجمالي من 200 ميكرولتر، ووضعها في sonicator حمام الماء. سونيكات الحمض النووي ل تسفر عن شظايا من حوالي 300 نوكليوتيدات.

تأكد من أن الحمض النووي هو القص عن طريق تشغيل 10 ميكرولترات من الحمض النووي غير المحمص و 10 ميكرولترات من الحمض النووي المقص، على هلام مشوي خنزير 1٪. كرر صوتنة، إذا لزم الأمر. لإضافة ذيل بذور بولي إلى النهاية الرئيسية الثلاثة للحمض النووي المطلق ، قم بإعداد رد فعل السياسة كما هو موضح في المخطوطة النصية واحتضان أنابيب التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

لتنقية رد فعل السياسة، إضافة 40 ميكرولترات من الخرز البارامغناطيسية اختيار حجم لكل عينة ودوامة أنبوب التفاعل. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم، طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع السائل في الجزء السفلي من الأنبوب.

نقل الأنابيب إلى رف المغناطيسي واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين أو حتى الحل هو واضح. إزالة بعناية عظمى وإضافة 200 ميكرولترات من الطازجة أعدت، 80٪ الإيثانول، دون إزعاج الخرز. احتضان العينات حتى الحل واضح.

ثم إزالة افراة وتكرار غسل الإيثانول. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب ووضعها مرة أخرى في الرف المغناطيسي، لإزالة أي السائل المتبقية. احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة، لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، للسماح لهم بالجفاف.

وإضافة 25 ميكرولترات من الماء إلى كل أنبوب. دوامة لهم لمدة خمس ثوان تقريبا أو ماصة صعودا وهبوطا. ثم، الطرد المركزي الأنابيب لجمع السائل في الجزء السفلي.

نقل الأنابيب إلى رف المغناطيسي والسماح لهم الجلوس لمدة دقيقتين تقريبا حتى الحل هو واضح. ثم، نقل المابير إلى أنبوب جديد دون إزعاج الخرز. وقد استخدم هذا البروتوكول لتوليد مكتبة نقل عالي الكثافة في سلالة A-baumannii ATCC 17978، من خلال الاقتران البكتيري باستخدام E-coli MFD DAP auxotroph، الذي يكرر pJNW684.

تم استخدام مكتبة متحولة A-baumannii المسحوبة لتحديد عوامل اللياقة البدنية ، وهي مهمة لمقاومة Colistin تحت تركيزات شبه مثبطة للميكروبات المضادة. بعد استنزاف مكتبة متحولة من الجينات التي تسهم في مقاومة Colistin ، تم عزل gDNA الإجمالي لسحب المكتبة المتبقية من السيطرة والثقافات التجريبية. تم تجزئة gDNA مع القص الميكانيكية وأضيفت ذيل السياسة إلى شظايا الحمض النووي استعدادا لتسلسل.

تم حساب تركيزات الحمض النووي وتم تحليل العينات باستخدام الكهرباء الشعرية المستندة إلى الرقائق ، لتأكيد البناء الناجح للمكتبة. أهم شيء أن نتذكر عند محاولة هذا الإجراء هو ضبط حجم التزاوج، استنادا إلى التهم CFU لسلالات مستهدفة محددة لتوليد مكتبة متحولة عالية الدقة. بالإضافة إلى ذلك, سلالة المتلقي يجب أن تكون حساسة لمقاومة المضادات الحيوية علامة, باستخدام transposon قبل الطفرات.

بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ حذف الجينات أو طريقة القول الصوتية لضرب الرؤوس الفردية التي تحصل عليها من النتائج التسلسلية والتحقق من صحة الجينات ذات الاهتمام في ظل الظروف المطعون فيها.