إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح بتحليل ChIP-Seq عالي الإنتاجية للعينات الأولية لفهم آليات تنظيم رابطة الدول المستقلة بشكل أفضل ، وآثاره على المرض. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في قابلية تكرار البيانات ، والتقليل بشكل كبير من وقت المختبر العملي. لقص الكروماتين ، أضف 70 ميكرولترا من المخزن المؤقت الكامل للتحلل الطازج بدرجة حرارة الغرفة إلى حبيبات خلية مثبتة بالجليسين ومجمدة ومذابة ذات أهمية ، لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، تليها دقيقة واحدة من إعادة التعليق بدون فقاعات.

احتضن العينة لمدة دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة ، قبل وضع الخلايا على الجليد. انقل الحبيبات المعلقة إلى أنبوب منخفض الارتباط سعة 0.65 مليلتر على الجليد ، قبل تحميل الأنبوب على حامل أنبوب الصوت. املأ أي فجوات بأنابيب التوازن التي تحتوي على 70 ميكرولتر من الماء ، واترك الخلايا تستقر في الحمام المائي لمدة دقيقة واحدة تقريبا قبل بدء الصوتنة.

بعد ثلاث دورات ، قم بإزالة العينات من جهاز الصوتنة لدوامة لطيفة ، وقم بتدوير الأنابيب بالنبض قبل وضعها مرة أخرى في الحامل. لتعديل الهيستون ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت tC1 الكامل إلى كل أنبوب من شريطين من ثمانية أنابيب ، وانقل 20 ميكرولترا من كل عينة من 16 عينة مشتركة بالكروماتين إلى أنابيب فردية من شرائط الشريحة ذات الثمانية أنابيب. اغسل أنابيب الكروماتين بمخزن مؤقت كامل tC1 سعة 80 ميكرولتر ، وقم بتجميع الغسالات في الأنابيب المناسبة لشرائط الثمانية أنابيب للرقاقة للحصول على حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر من المحلول لكل أنبوب.

أضف الحجم المناسب من الجسم المضاد إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TBW1 ، وسرعة الدوامة ، والدوران النبضي. ثم أضف 70 ميكرولترا من tBW1 ، و 30 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة إلى كل أنبوب من شريط جديد مكون من ثمانية أنابيب. بعد ذلك ، قم بتدوير وعاء من محلول حبة البروتين A جيدا ، وأضف خمسة ميكرولترات من الخرز لكل 0.5 ميكروغرام من الجسم المضاد إلى شريط أنبوبي جديد.

قم بتدوير شريط الخرز ، واملأ الصف الأخير من معالج سائل الرقاقة بشرائط ذات ثمانية أنابيب مصنفة وفارغة. ثم اتبع مواصفات برنامج الشريحة 16-I النقية 200 D لوضع بقية الشرائط ، وقم بتحميل المخازن المؤقتة في المواضع الصحيحة. بعد التسلسل ، التقط الخرزات في مغناطيس شريطي مكون من ثمانية أنابيب ، وانقل 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعلامات إلى كل أنبوب.

مع إزالة الأنابيب من المغناطيس ، اخلطيها برفق ، حتى تصبح محاليل الخرز متجانسة ، قبل وضع الأنابيب المعاد تغطيتها في ThermoMixer مسخن مسبقا لمدة ثلاث دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة شرائط الشريحة المكونة من ثمانية أنابيب في الصف الأخير من معالج سائل الرقاقة ، وأضف ميكرولترين من Rnase A إلى كل عينة. ثم قم بتدوير النبض في الأنابيب المعاد تغطيتها ، واخلطها برفق ، حتى تصبح محاليل الخرز متجانسة.

لتنقية شظايا الحمض النووي الموسومة ، انقل 100 ميكرولتر من عينات الحمض النووي المتشابكة D إلى أنابيب فردية سعة 1.5 مليلتر ، واغسل الأنابيب ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي لكل أنبوب. نبض الغسالات في الأنابيب المناسبة ، وقم بتحميل العينات على الأعمدة. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع جديدة سعة 1.5 مليلتر ، وأضف تسعة ميكرولترات من 55 درجة مئوية Tris-EDTA المؤقت مباشرة إلى مصفوفات الأعمدة.

بعد دقيقة واحدة ، قم بالطرد المركزي للأعمدة ، وانقل التسعة ميكرولترات من الشطف من كل عمود إلى شريط جديد من ثمانية أنابيب على الجليد. قم بإزالة شظايا الحمض النووي مرة أخرى كما هو موضح ، ولكن بثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت Tris-EDTA ، وقم بتجميع الشطف مع محلول جزء الحمض النووي الذي تم حصاده مسبقا. لتضخيم عينات شظايا الحمض النووي المنقى، امزج العينات بماصة متعددة القنوات، وقم بتنفيذ برنامج تضخيم بالعدد المناسب من الدورات.

بعد التضخيم ، استخدم مغناطيس اللوحة لالتقاط الخرزات ، وتخلص من المادة الطافية. اغسل الخرزات ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ لكل غسلة ، دون تعطيل حبيبات الخرزة. بعد الغسيل الأخير ، استخدم طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر لإزالة أي إيثانول زائد ، واترك الخرزات تجف لمدة 10 دقائق ، أو حتى تظهر تشققات في حبيبات الخرز.

أضف 40 ميكرولترا من الماء الدافئ مسبقا إلى كل عينة مجففة ، وأغلق اللوحة قبل الدوامة تماما ، وانبض الدوران لفترة وجيزة. ثم قم بتحديد كمية الحمض النووي ، باستخدام مقايسة القياس الكمي الفلوري ، وفقا للبروتوكولات القياسية. تظهر قياسات حجم شظايا الكروماتين المقصوصة قابلية كبيرة للتكرار مع ملاحظة أكثر من 70٪ من العينات بين 100 و 500 زوج أساسي لمدة 14 دورة.

كما هو موضح ، فإن الدورة التي تكون فيها شدة العينة الموسومة نصف متوسط الحد الأقصى هي الأمثل لتحديد الدورة. يتم الحصول على أفضل بيانات التسلسل عندما يتراوح أكثر من 85٪ من شظايا الحمض النووي بين 200 إلى 1000 زوج أساسي. في مسارات التخصيب التمثيلية هذه لأربعة مواقع جينية ، تظهر المسارات الفردية لكل عينة جودة تعيين عالية ونسبة إشارة إلى ضوضاء.

أول موقعين على جينات جيدة التعبير عنها في هذه الأنواع من الخلايا ، في حين أن الجينات الموجودة في الموقعين الأخيرين لا يتم التعبير عنها ، وتعمل كعناصر تحكم في الخلفية. بالنسبة لغالبية المقارنات الزوجية ، تظهر مؤشرات ارتباط بيرسون أكثر من 90٪ من الارتباط ، مما يشير إلى مستوى عال من الاتساق بين التكرارات البيولوجية. في حين أن المواقع الخاصة بنوع الخلية تظهر تخصيبا عاليا في الخلايا المناسبة ، فإن جين التدبير المنزلي يظهر تعديلا ثابتا للغاية في هيستون.

لا يزال تحليل الارتباط بين مجموعة بيانات ChIP-Seq التي تم إجراؤها من عينات تحتوي على أقل من 100 ، 000 خلية يظهر قابلية عالية للتكاثر والارتباط يصل إلى 10 ، 000 خلية. ومع ذلك ، هناك خلفية متزايدة مع تقليل أعداد الخلايا ، بالإضافة إلى انخفاض في معاملات الارتباط الخاصة بها. يعد التحلل الصحيح للخلايا أمرا ضروريا لتوليد بيانات عالية الجودة ، حيث وجدنا أن تحلل الخلايا غير المكتمل يؤثر على بقية البروتوكول.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن اختبار العديد من تعديلات هيستون المختلفة وعوامل النسخ على أنواع مختلفة من الخلايا ذات الأهمية لتعزيز فهمنا للعناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة.