التصوير البصري المستند إلى الصمامات الثنائية الضوئية لتسجيل ديناميكيات الشبكة بدقة أحادية الخلايا العصبية في اللافقاريات غير المعدلة وراثيا

تمثل هذه المقالة وصفا مفصلا لكيفية استخدام مصفوفة الثنائيات الضوئية والأصباغ الحساسة للجهد لتسجيل إمكانات الفعل من أعداد كبيرة من الخلايا العصبية في وقت واحد. بالمقارنة مع تصوير الكالسيوم للنشاط العصبي ، وهو غير مباشر ، فإن الأصباغ الحساسة للجهد التي نستخدمها تسجل إمكانات عمل مشابهة مباشرة لتسجيلات الأقطاب الكهربائية الحادة ، ولكن عبر العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد. يمكن تكييف سير عمل التصوير البصري لدينا لتصور نشاط الشبكة بسرعة باستخدام خلية عصبية واحدة ودقة جهد عمل واحد في مجموعة متنوعة من اللافقاريات غير المعدلة وراثيا وحتى أنظمة الفقاريات.

بالإضافة إلى ذلك ، سيكون إيفان هيل من مختبري توضيحا للإجراءات الواردة في بروتوكولنا. ابدأ بتخدير Aplysia californica وزنه 40 جراما وتثبيته على الجانب البطني لأعلى في طبق تشريح مبطن بالشمع. باستخدام مقص التشريح ، قم بعمل شق خط الوسط بطول سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات على طول المدى الأمامي للقدم وقم بتثبيت سدائل القدم على جانبي الشق للكشف عن جزء من الجهاز العصبي المركزي والكتلة الشدقية.

استخدم الملقط ومقص التشريح لتشريح الكتلة الشدقية بعناية ، والكشف عن العقد الدماغية ، وقطع الأعصاب التي تعصيب جسم لاستئصال الجهاز العصبي المركزي ، وترك طول طويل من العصب ليتم تحفيزه. استخدم دبابيس دقيقة لوضع الجهاز العصبي المركزي في طبق مبطن بالتلاط الصناعي المليء بالمحلول الملحي وقم ببث الطبق بالمحلول الملحي الذي يمر عبر جهاز تبريد بلتيير للحفاظ على درجة حرارة التحضير من 15 إلى 16 درجة مئوية. استخدم الملقط ومقص التشريح المجهري لإزالة النسيج الضام الزائد من الأعصاب وتشريح جزء سطحي من الغمد على العقدة أو العقد المراد تصويرها.

ثم اغمس الجهاز العصبي المركزي النظيف في محلول 0.5٪ جلوتارالديهايد في محلول ملحي لمدة 20 ثانية قبل إعادة الجهاز العصبي المركزي إلى الطبق المبطن باللدائن المملح لشطف أي غلوتارالديهايد زائد. لتحضير محلول عمل من الصبغة الحساسة للجهد ، أضف 500 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى كمية صلبة معدة مسبقا من RH 155 لتحقيق تركيز صبغة نهائي يبلغ 0.3 ملليغرام لكل ملليلتر. واستخدم موزعا صغيرا محمولا باليد لتحميل 200 ميكرولتر من المحلول في قطعة من أنابيب البولي إيثيلين بقطر مماثل لقطر العقدة المراد تلطيخها.

باستخدام معالج دقيق ، ضع نهاية الأنبوب بعناية فوق العقدة المستهدفة ، وقم بخفض الأنبوب حتى يشكل ختما محكما فوق العقدة. أدر مقبض قضيب الموزع الدقيق كل خمس دقائق لمدة ساعة لإجبار المزيد من الصبغة على العقدة ، وفحص العينة في 30 دقيقة للتأكد من حدوث تلطيخ مناسب. بعد التلوين ، مع الحفاظ على الأضواء خافتة ، ضع مادة عازلة مناسبة على يسار ويمين المكان الذي سيتم فيه وضع المستحضر في غرفة التصوير المحتوية على محلول ملحي ، ثم اغمر الجهاز العصبي المركزي في الغرفة.

اضغط على قطعة ذات حجم مناسب من الغطاء فوق المنديل واضغط بقوة على الغطاء لتسطيح الأنسجة دون الإضرار بالخلايا العصبية. ثم ضع غرفة التصوير تحت مجهر تشريح. في حالة تحفيز العصب لاستنباط برنامج حركي وهمي ، قم بإذابة جزء من أنابيب البولي إيثيلين PE100 بعناية فوق اللهب مع سحب طرفي جزء الأنبوب برفق وقطع المستدق الناتج عند النقطة المطلوبة.

بعد ذلك ، قم بإرفاق طول أنابيب البوليمر المرنة ذات الجدران السميكة بالطرف الخلفي لقطب شفط البولي إيثيلين. ثم استخدم قسم الفم لإنشاء ضغط سلبي وسحب كمية صغيرة من المحلول الملحي من خلال الطرف المدبب لقطب الشفط. ارسم نهاية العصب المراد تحفيزه في القطب الكهربائي تحت المجهر وتأكد من أن المحلول الملحي الموجود في القطب يفتقر إلى الفقاعات التي يمكن أن تقاطع التوصيل الكهربائي.

لتصوير العقدة ، انقل الغرفة إلى جهاز التصوير وابدأ التروية المالحة من خلال غرفة التسجيل. ضع مسبارا لدرجة الحرارة بالقرب من المستحضر واضبط درجة الحرارة حسب المناسبة للأنواع التي يتم تصويرها. ضع سلكا فضيا ملودا أسفل قطب الشفط ، وتأكد من أنه يلامس المحلول الملحي في القطب الكهربائي وضع سلك كلوريد فضي فضي في محلول ملحي بالقرب من قطب الشفط.

اخفض عدسة الغمر في الماء في المحلول الملحي وأغلق الحجاب الحاجز القاعدي. ارفع أو خفض مكثف المرحلة الفرعية واضبط التركيز البؤري حتى تصبح حواف الحجاب الحاجز في تركيز حاد ، مما يخلق إضاءة Kohler. ركز على منطقة التحضير المراد تصويرها والحصول على صورة للعقدة ذات الأهمية باستخدام الكاميرا الرقمية parfocal

اضبط مفتاح كسب لوحة التحكم على 1X وانقر فوق زر شدة ضوء الراحة للتحقق من متوسط شدة ضوء الراحة للصمامات الثنائية. اضبط مستوى الجهد المرسل من المحفز إلى مصدر طاقة مصباح LED واستمر في التحقق من متوسط مستوى شدة ضوء الراحة حتى يصبح في النطاق المطلوب. ثم اضبط مفتاح كسب لوحة التحكم على 100X للتسجيل وتحقق جيدا من أن الزنبرك أو طاولة الهواء تطفو.

مع استمرار تعتيم الأضواء، اضبط مدة الملف ومساره واسمه في برنامج التصوير وانقر فوق أخذ البيانات للحصول على ملفات تصل إلى سعة ذاكرة الوصول العشوائي المتوفرة للكمبيوتر. احرص على البقاء ثابتا أثناء التسجيل لأن الاهتزازات الصغيرة يمكن أن تدخل عناصر كبيرة في بيانات التسجيل البصري. لعرض البيانات مباشرة بعد الاستحواذ ، استخدم الوظيفة المتراكبة لتركيب البيانات التي تم جمعها بواسطة جميع الثنائيات البالغ عددها 464 فوق صورة العقدة وانقر فوق أي من الثنائيات الممثلة في البرنامج لتوسيع البيانات المسجلة على شاشة تتبع منفصلة.

لتحقيق محاذاة دقيقة للصمامات الثنائية فيما يتعلق بالتحضير ، أدخل عوامل X و Y والتكبير على النحو الذي يحدده اختبار الثقب. لتعظيم رؤية إمكانات الإجراء وتحسين إنتاجية الخلايا العصبية لفرز السنبلة اللاحقة ، قم بفرض مرشح Butterworth لتمرير النطاق مع خمسة و 100 قطع هرتز لإزالة كل من الضوضاء منخفضة وعالية التردد. لحفظ البيانات البصرية التي تمت تصفيتها كملف نصي للتحليل اللاحق، على شاشة الصفحة، حدد مربع عامل تصفية TP.

وضمن علامة تبويب الإخراج ، حدد حفظ الصفحة ك ASCII. ثم أدخل اسم ملف مناسب في مربع الحوار الذي يظهر. يؤدي ملامسة الجلد مع مفترس نجم البحر إلى الهروب من سباحة Tritonia diomedia التي تتكون من سلسلة إيقاعية من ثني الجسم بالكامل التي تدفعه بعيدا إلى بر الأمان.

في هذا الشكل ، يتم عرض البيانات الأولية والمفلترة من 20 صمامات ثنائية تسجل النشاط قبل وأثناء وبعد تحفيز عصب الدواسة ثلاثة. مباشرة بعد الاستحواذ ، يمكن عرض الإشارات المقاسة بواسطة جميع الثنائيات البالغ عددها 464 من مصفوفة التسجيل طوبوغرافيا على صورة للتحضير في برنامج التصوير. في هذا التحليل ، أسفر فرز السنبلة لآثار الصمام الثنائي المصفى مع تحليل المكونات المستقل ، أو ICA ، عن 53 أثرا عصبيا فريدا ، 30 منها موضحة هنا.

يثير محفز الذيل المكروض بشدة ل Aplysia californica موجات متكررة من استجابة هروب إيقاعية من جزأين تتكون من فترة ركض من عدة دورات من اندفاع الرأس وسحب الذيل التي تحرك بسرعة إلى الأمام وفترة زحف لاحقة. في هذا التحليل التمثيلي ، بعد دقيقة واحدة من التسجيل البصري المستمر لمدة 20 دقيقة ، تم تحفيز عصب الدواسة التاسع لاستنباط تسلسل برنامج الركض الحركي. تم تعيين التوزيعات المكانية الاحتمالية الغوسية للإشارات من جميع الخلايا العصبية المسجلة البالغ عددها 81 على العقدة.

كشف تقليل الأبعاد المطبق على التسجيل الكامل أن مرحلتي الركض والزحف لبرنامج الهروب احتلت مناطق مميزة وتشكل مسارات مختلفة في مساحة المكون الرئيسي. عند محاولة هذا البروتوكول ، تشمل الاعتبارات المهمة: تحسين التلوين ، وتقليل الاهتزاز ، وتوجيه ما يكفي من الضوء من خلال التحضير إلى المساعد الرقمي الشخصي مع تقليل التبييض الضوئي للصبغة. تتضمن أمثلة تحليل ما بعد الاستحواذ الذي كشف عن رؤى الشبكة على مستوى السكان اكتشاف المجموعة الوظيفية من خلال تجميع الإجماع في خوارزمية التعلم غير الخاضعة للإشراف وتقليل الأبعاد باستخدام تحليل المكونات الرئيسية.

يتيح الجمع بين نظام التصوير القائم على مصفوفة الثنائيات الضوئية واستخدامنا للأصباغ الماصة الحساسة للجهد مراقبة تطور الشبكة الديناميكية على مدى فترات زمنية طويلة.