اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان
November 19th, 2020
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة مكيفة لاشتقاق, توسيع, و cryopreserve خلايا البطانية الأوعية الدموية المجهرية التي تم الحصول عليها عن طريق التمييز بين الخلايا الجذعية متعددة القدرات الناجمة عن النشاط البشري, ودراسة خصائص حاجز الدم في الدماغ في نموذج الجسم الحي السابق.
BMECs المتولدة من iPSC نماذج تجريبية جديدة لدراسة وظيفة الحاجز الدموي في الدماغ والخلل الوظيفي. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لفحص ما إذا كانت BMECs تحتفظ بخصائص الحاجز الخاصة بها بعد التمدد والحفظ بالتبريد. تتيح هذه التقنية توليد BMECs الخاصة بالأمراض من المرضى الذين يعانون من اضطرابات يلعب فيها اضطراب الحاجز الدموي الدماغي دورا في الفيزيولوجيا المرضية للمرض.
للحث على تمايز BMEC من iPSCs البشرية, غسل ثقافة iPSC المتقاربة مع DPBS مرة واحدة قبل احتضان الخلايا بالحجم المناسب من EDTA الأنزيمي لمدة خمس دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية. عندما يتم الحصول على تعليق خلية واحدة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من وسط الخلايا الجذعية مكملا ب 10 مثبطات ميكرومولار ROCK للعد. خفف الخلايا إلى 1.56 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل تركيز سنتيمتر مكعب وزرع ملليلترين من الخلايا في آبار فردية ذات قاع مسطح من ستة آبار.
بعد 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بوسط E6 وأعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة أربعة أيام أخرى. لتنقية BMECs المشتقة من iPSC ، قم بتغطية ألواح الزراعة الفرعية بالحجم المناسب من محلول الكولاجين الوردي والفيبرونيكتين المحضر حديثا لكل بئر واحتضان الألواح لمدة ساعتين على الأقل عند 37 درجة مئوية. في اليوم السادس من التمايز ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في الحجم المناسب من وسط مصل البطاني البشري الطازج المكمل ب B27 ، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ، وحمض الريتينويك.
لتحليل TEER ، قم بوضع الخلايا المتمايزة في كل بئر من الكولاجين والفيبرونيكتين المطلي بلوحة مصفاة 12 من الوسائل. لتحليل نشاط ناقل التدفق ، قم بوضع الخلايا في كل بئر من الكولاجين والفيبرونيكتين المطلي بلوحة قاع مسطحة 24 بئرا. بعد 24 ساعة من الزراعة الفرعية ، استبدل المادة الطافية في كل بئر بوسط خال من مصل البطان البشري الطازج المكمل فقط بمكمل B27.
لقياس خصائص الحاجز الدموي الدماغي ل BMECs باستخدام TEER ، اشحن أداة TEER طوال الليل وامسح الجهاز وأقطاب عود تناول الطعام برفق بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعها في غطاء الأمان. قم بتشغيل الطاقة ومعايرة مقياس أوم وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية واشطفها مرة واحدة باستخدام 70٪ من الإيثانول ومرة واحدة باستخدام DPBS.
ضع الطرف الأقصر من القطب في الغرفة غير النمطية للملحق والطرف الأطول في الغرفة القاعدية الجانبية لبئر فارغ. بعد قياس استجابة التحكم السلبية ، اشطف الأقطاب الكهربائية بسرعة كما هو موضح وقم بقياس البئر التجريبي الأول. بعد تسجيل جميع القياسات ، اشطف أقطاب عود تناول الطعام مرة أخرى ، امسح الأقطاب الكهربائية برفق واتركها تجف في الهواء في غطاء الأمان.
لتقييم نشاط ناقل التدفق للخلايا ، في اليوم الثامن من الاستزراع ، عالج العدد المناسب من الآبار بمحلول مثبط ناقل التدفق 10 ميكرومولار وضعه في حاضنة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، عالج الخلايا بمحلول ركيزة ناقل تدفق 10 ميكرومولار لمدة ساعة واحدة في الحاضنة. في نهاية الحضانة ، اغسل كل بئر مرتين ب 500 ميكرولتر من DPBS لكل بئر قبل تحلل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS مكملة ب 5٪ Triton-X لكل بئر.
بعد خمس دقائق ، استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس تألق الخلايا المحللة عند إثارة 485 نانومتر وانبعاث 530 نانومتر. بالنسبة للآبار غير المستخدمة في مقايسة الناقل ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS قبل التثبيت باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد لكل قياس لنوى الخلية. بعد يوم واحد من الثقافة في E6 متوسط, مورفولوجيا الخلية مماثلة لتلك الموجودة في iPSCs.
في اليوم الرابع, الخلايا متميزة بشكل واضح عن iPSCs وتغطي معظم البئر. يومين من الثقافة في وسط خال من مصل البطان البشري يحفز مظهرا ممدودا ومرصوفا بالحصى في الخلايا. في اليوم الثامن ، تشكل الخلايا الفردية نمطا مرصوفا بالحصى في الغالب.
يمكن إجراء اختبار ينبت لإثبات إمكانات تولد الأوعية الدموية لمركبات BMECs المشتقة من iPSC. هذا يؤدي إلى تطوير هياكل تشبه الأنبوب بعد ثلاثة أيام من علاج عامل النمو. تعبر BMECs المشتقة من iPSC التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول عن بروتينات التوصيل الضيقة المعبر عنها في الخلايا البطانية في الدماغ والرئة والكبد والكلى ، بالإضافة إلى العلامات البطانية الوعائية المعبر عنها عند الحاجز الدموي الدماغي.
كما لوحظ, 48 ساعات بعد الاستزراع الفرعي والتغير المتوسط المشتق من iPSCs BMECs تظهر قيم TEER ضمن النطاق الموصوف ل BMECs المشتقة من iPSC والتي تم زراعتها بشكل مشترك مع الخلايا النجمية الأولية للفئران. كما لوحظ نشاط ناقل التدفق في هذه المرحلة. بعد الحفظ بالتبريد ، تكون قياسات TEER أقل مقارنة ب BMECs المشتقة حديثا.
يكشف تحليل اللطخة الغربية عن انخفاض مستويات علامات التوصيل الضيقة ، مثل occludin ، بينما تظهر كيمياء الخلايا المناعية أنماطا منمشة و / أو مهترئة لبروتينات التوصيل الضيقة. كثافة iPSC عالية جدا أو منخفضة جدا سوف تؤثر على كفاءة التمايز وتؤثر على تطوير خصائص حاجز الدم في الدماغ المناسبة. تتيح هذه الطريقة التحقيق في خصائص الحاجز والإشارات الخلوية ونشاط الناقل باستخدام BMECs الفردية لنمذجة علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لوظيفة الحاجز الدموي الدماغي.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لتمييز وتوسيع وتجميد الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الدماغية (BMECs) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs). تركز على التحقيق في خصائص حاجز الدم-الدماغ باستخدام نموذج ex vivo.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
الخلفية
- تلعب الخلايا BMECs دورًا حيويًا في الحفاظ على سلامة حاجز الدم-الدماغ.
- ترتبط الإخلالات في حاجز الدم-الدماغ بالعديد من الاضطرابات العصبية.
- توفر الخلايا iPSCs البشرية نموذجًا لنهج الطب المخصص.
- يسمح البروتوكول بإنتاج خلايا BMECs الخاصة بالمرض.
غرض الدراسة
- تحسين بروتوكول التمايز لخلايا BMECs المشتقة من الخلايا iPSCs.
- تقييم تأثيرات التوسع والتجميد على خصائص الحاجز.
- التحقيق في انطباق هذه الخلايا BMECs في دراسة وظيفة حاجز الدم-الدماغ.
الطرق المستخدمة
- تعتمد الطريقة على تمايز الخلايا iPSCs البشرية إلى BMECs عبر بروتوكول زراعة خلوية تدريجي.
- تشمل الخطوات الرئيسية الزراعة في وسط محدد، واستخدام مثبطات ROCK، واختبارات transwell لتقييم خصائص الحاجز.
- تُستخدم قياسات TEER واختبارات ناقلات التدفق الخارجي للتحليل الوظيفي.
- يتم مراقبة شكل الخلايا وكفاءة التمايز على مدار ثمانية أيام.
النتائج الرئيسية
- حافظت خلايا BME على خصائص التلاصق الضيق والشكل المناسب بعد التمايز.
- أظهرت قيم TEER سلامة وظيفية؛ ومع ذلك، قلل التجميد من هذه الخصائص.
- تم التحقق من نشاط ناقلات التدفق الخارجي، مما يشير إلى حفظ الوظيفة.
- تسمح المنهجية بنمذجة آليات حاجز الدم-الدماغ في الصحة والمرض.
الاستنتاجات
- يمكن هذا البروتوكول من إنتاج خلايا BMECs المشتقة من المرضى لدراسة وظيفة حاجز الدم-الدماغ.
- يوفر رؤى حول تأثيرات التجميد على خصائص الحاجز.
- تمتلك الدراسة آثارًا على تطوير استراتيجيات علاجية تستهدف حاجز الدم-الدماغ.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Human iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (BMECs) enable the development of ex vivo blood-brain barrier (BBB) models for early-stage CNS drug discovery and mechanistic de-risking. This protocol supports the generation, expansion, and cryopreservation of BMECs, facilitating disease-relevant system modeling and functional validation of BBB properties. The approach enhances predictive confidence for BBB permeability and transporter function, directly impacting portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of BBB integrity and transporter activity in disease-relevant human systems.
- Supports mechanistic de-risking by modeling patient-specific BBB dysfunction.
- Facilitates functional target validation for CNS drug delivery strategies.
- Provides a platform for hypothesis testing of BBB-related therapeutic mechanisms.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized BMEC monolayers for quantitative TEER and efflux transporter assays.
- Enables reproducible assessment of compound permeability across the BBB.
- Supports assay scalability and platform reuse for high-content screening.
- Prepares validated biological systems for downstream co-culture and organoid workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro BBB models with translational biomarker endpoints such as TEER and transporter activity.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of CNS drug candidates.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on human-relevant BBB function.
- Supports modeling of BBB dysfunction in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions iPSC-derived BMECs as a bridge from early discovery to preclinical CNS drug evaluation, supporting both target validation and lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of BBB mechanisms and pathway clarification in human-derived systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative TEER and transporter activity readouts for compound evaluation.
- Analytics: Delivers standardized measurements for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with preclinical BBB biomarkers and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS drug discovery and disease modeling initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BBB permeability and transporter function for CNS portfolios.
- Operational Value: Standardizes BMEC derivation, expansion, and cryopreservation for reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing human-relevant BBB data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional BBB validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, differentiation, and endothelial cell biology.
- Needs access to TEER instrumentation, multi-plate readers, and immunocytochemistry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell density, media, and matrix coatings for reproducibility.
- Adaptation across disease models may require protocol optimization for specific iPSC lines.
- Lower TEER and marker localization after cryopreservation may limit some downstream applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Brain Microvascular Endothelial Cell (BMEC) Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)
1:46
iPSC-Derived BMEC Subculture and Purification
3:02
Trans-Endothelial Electrical Resistance (TEER) Measurement and Analysis
4:09
Efflux Transporter Activity and Analysis
5:22
Results: Representative BMEC Differentiation and Characterization After Passaging, Subculture, and Cryopreservation
7:18
Conclusion
