اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

هذا البروتوكول مهم لأنه يتيح استخدام أنظمة الترجمة الحالية الخالية من الخلايا لتحليل الجزيء الفردي للترجمة حقيقية النواة النشطة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تحافظ على خصائص الترجمة بالجملة ، وتوفر دقة جزيء واحد ، وهي سهلة نسبيا للتكيف مع فحوصات الترجمة الجماعية الأخرى. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام ترجمة خال من الخلايا تم التحقق منه لتمكين الترجمة الفعالة المعتمدة على الحد الأقصى في ظل ظروف مجمعة.

سيوضح هذا الإجراء هونغيون وانغ ، باحث مشارك ، وأنتوني غابا ، عالم أبحاث أول من مختبر شياو هوي كو. قبل ثلاث ساعات على الأقل من إجراء تجربة جزيء واحد ، قم بتشغيل حاضنة المجهر وقلل تدفق الهواء إلى معدل منخفض لتجنب الاضطراب الصوتي المفرط للتجربة. ثم اضبط درجة حرارة الحاضنة على درجة الحرارة المثلى المحددة لنظام الترجمة الخالي من الخلايا.

قبل ساعة واحدة على الأقل من التجربة ، اضغط على زر طاقة الليزر خلف صندوق الليزر ، وأدر مفتاح أمان الليزر ، واضغط على زر البدء لتشغيل الليزر. قم بتشغيل المجهر وحدد وضع التصوير والهدف ومجموعة التصفية. قم بتشغيل كاميرا EMCCD ووحدة التحكم في المسرح ومضخة الحقنة والكمبيوتر وافتح الكاميرا والليزر والمرحلة الآلية وبرنامج مضخة الحقنة.

في برنامج التحكم بالليزر، انقر فوق "اتصال" لضبط شدة الليزر، وقم بإلغاء تحديد مربع الغالق وانقر فوق التحكم لسحب شريط انزلاق الشدة في النافذة المنبثقة للتحكم بالليزر. أدخل عمق الاختراق لضبط الليزر على الزاوية المطلوبة وتأكد من إغلاق صندوق الغالق للحفاظ على الليزر في وضع إيقاف التشغيل عند عدم التصوير. عندما تبرد الكاميرا وتستقر إلى درجة حرارة العمل المحددة لها ، في برنامج الكاميرا ، حدد الحركية لوضع الاستحواذ وأدخل وقت التعريض وطول السلسلة الحركية ومعلمات قيمة كسب مضاعفة الإلكترون.

حدد الدليل وقم بتعيين أسماء الملفات لحفظ ملف صورة البيانات. اضبط مضخة الحقنة على معدل تدفق متواضع إلى سريع وأضف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى أنبوب الطرد الدقيق. أدخل طرف أنبوب مضخة الحقنة في محلول الإيثانول واستخدم برنامج مضخة الحقنة لتبديل مضخة الحقنة بين أوضاع السحب والتوزيع لغسل الأنبوب ثلاث مرات بالإيثانول وثلاث مرات بالماء الخالي من RNase.

بعد الغسيل النهائي بالماء ، امسح طرف الأنبوب على منديل مناديل نظيفة لإزالة أي ماء متبقي من داخل الأنبوب وضع نهاية الأنبوب في أنبوب دقيق نظيف. لتثبيت الرنا المرسال المرسال بثلاثة أطراف أولية ، ضع غرفة التدفق في حامل عينة المجهر بحيث يكون جانب الغطاء متجها لأسفل وقم بتأمين الغرفة بشريط لاصق. استخدم الشريط لتغطية مداخل ومخارج قناة التدفق غير المستخدمة وأضف 1.5 ضعف حجم محلول الستربتافيدين 200 ميكروغرام لكل مليلتر إلى قناة التدفق.

بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اغسل القناة وامسحها ثلاث مرات بثلاثة أضعاف حجم مخزن الغسيل T50 لكل غسلة وأنسجة المختبر المطوية. بعد الغسيل الأخير ، ضع قطرة من زيت الغمر على هدف المجهر وضع الحامل والغرفة على مرحلة المجهر. ثم قم بإحضار الهدف بالقرب من الغطاء حتى يلامس زيت الغمر على الهدف زلة الغطاء وحرك مرحلة العينة بحيث يكون موضع قناة التدفق أعلى العدسة الموضوعية مباشرة.

على شاشة اللمس الخاصة بالتحكم في المجهر، حدد علامة تبويب التركيز البؤري وانقر فوق بحث التركيز البؤري وابدأ الصوت. سيتم سماع صوت تنبيه عند تحقيق مستوى التركيز البؤري بنجاح. في برنامج الكاميرا، حدد الوضع المباشر.

في برنامج التحكم بالليزر ، افتح مصراع الليزر واضبط مستوى شدة الليزر. راقب الصورة الفلورية في الوقت الفعلي في الوضع المباشر وفي شاشة اللمس للتحكم في المجهر باستخدام التحكم الدقيق في الخطوة لضبط موضع الهدف. في برنامج الكاميرا ، حرك المرحلة لتقييم مستوى خلفية التألق في مناطق مختلفة من سطح اكتشاف قناة التدفق.

إذا كان التألق منخفضا ، فأوقف الوضع المباشر وأغلق غالق الليزر في برنامج التحكم بالليزر واستبدل المخزن المؤقت للغسيل من قناة التدفق بضعف حجم محلول mRNA البيوتيني. بعد 15 دقيقة ، اغسل القناة ثلاث مرات بثلاثة أضعاف حجم المخزن المؤقت المتوافق مع الترجمة لكل غسلة. للكشف عن جزيء واحد ، قم بتجميع ثلاثة أضعاف حجم مزيج الترجمة المذاب حديثا بدون mRNA واستكماله بتركيز محسن من الأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت في أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد وقم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع المزيج في قاع الأنبوب.

انقل مزيج الترجمة إلى داخل غطاء أنبوب microfuge سعة 700 ميكرولتر واضبط مضخة الحقنة على وضع السحب. أدخل طرف أنبوب المضخة في مزيج الترجمة وابدأ سحب المحقنة. عندما يدخل مزيج الترجمة بالكامل إلى أنبوب المضخة ، أوقف السحب ، واعكس إعدادات مضخة الحقنة إلى وضع الاستغناء ، واضبط التدفق على المعدل الأمثل لتسليم مزيج الترجمة.

ابدأ تشغيل المحقنة وأوقفها للسماح لخليط الترجمة بالوصول إلى نهاية الأنبوب حسب الضرورة وإدخال طرف أنبوب المضخة في مدخل قناة التدفق ، مع الحرص على تجنب الفقاعات. قم بربط الحامل المعدني المصنوع خصيصا على لوحة حامل عينة المجهر لتثبيت الاتصال وتقييم تركيز المجهر ومنطقة التصوير. تأكد من صحة معلمات الحصول على الأفلام وأنه تم إدخال اسم الملف والدليل المناسبين لحفظ الملفات.

حرك المسرح للسماح بتصوير منطقة في وسط سطح اكتشاف قناة التدفق. وضمن علامة التبويب التركيز البؤري التلقائي المستمر ، انقر فوق أزرار البدء. سيتم سماع صوت تنبيه عندما يتم تحقيق مستوى التركيز البؤري بنجاح.

بعد تقليل الإضاءة المحيطة ، افتح غالق الليزر وانقر فوق زر أخذ الإشارة لبدء التسجيل. بعد خمس ثوان، أدخل الأمر run لتسليم مزيج الترجمة إلى قناة التدفق. ثم سجل البيانات لمدة تصل إلى ساعتين بدقة 0.5 إلى ثانيتين لكل إطار زمني.

لتحليل أحداث ربط Cy3 ANTI-FLAG ، تم حساب شدة التألق لبقع علم ألفا Cy3 المختارة إطارا تلو الآخر للفيلم بأكمله وتوصيلها لتشكيل مسار شدة. يمكن أن تبدو المسارات الأولية صاخبة وقد تتطلب تحسينا باستخدام مرشح غير خطي للأمام / للخلف لتقليل ضوضاء الخلفية. يمكن تحقيق مزيد من التحسين باستخدام خوارزميات الكشف عن الخطوات لرقمنة المسارات.

يتسبب ارتباط الأجسام المضادة بعديد الببتيد الناشئ في زيادة فورية في التألق ، بينما يؤدي تفكك عديد ببتيد الأجسام المضادة إلى انخفاض فوري في التألق. يتناسب الرسم البياني لوقت السكون ل mRNA لعلم luciferase مع التوزيع الطبيعي اللوغاريتمي وينتج عنه معدل تخليق الببتيد يبلغ 2.5 زائد أو ناقص 0.1 من الأحماض الأمينية في الثانية. يتناسب الرسم البياني لوقت الوصول الأول مع الوظيفة العادية المتغيرة ، مما يوضح الدرجة العالية من عدم التجانس في نشاط ترجمة الرنا المرسال الفردي.

كما يشير الرسم البياني ، يمكن أن يبدأ أول حدث تخليق الببتيد على جزيئات mRNA أحادية علم لوسيفيراز في وقت مبكر يصل إلى دقيقتين وفي وقت متأخر يصل إلى 20 دقيقة بعد تسليم مزيج الترجمة. بالمقارنة مع الترجمة باستخدام mRNA لعلم luciferase ، أظهر الرسم البياني لأول مرة في وقت الوصول مع ترجمة mRNA لعلم دبوس الشعر ربط أبطأ للأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن استخدام قياسات التلألؤ السائب من تفاعلات الترجمة الخالية من الخلايا مع نفس mRNAs لا يحل الاختلافات في حركية الترجمة.

توفر دقة الجزيء الفردي لهذا الاختبار مزيدا من الأفكار الحركية للترجمة المعتمدة على الغطاء والتي لا يمكن تحقيقها بسهولة من خلال الأساليب الأخرى. الترجمة الخالية من الخلايا حقيقية النواة حساسة للاختلافات الصغيرة والظروف التجريبية. لذلك ، يعد الاهتمام بالتفاصيل والاتساق أمرا بالغ الأهمية عند استخدام هذا الاختبار للكشف بدقة عن الاختلافات الصغيرة في الترجمة.