بروتوكول حقن الدهون لقياسات البلورات التسلسلية في السنكروترون الأسترالي

يوفر هذا البروتوكول الفرصة للعلماء لتوصيف بلورات البروتين المضمنة في مواد عالية اللزوجة ، بالإضافة إلى المواد اللينة الأخرى التي يصعب توصيفها حاليا باستخدام الإعدادات الحالية. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تحضير العينات في محاقن زجاجية ، مثبتة مباشرة على الحاقن ، مما يجعل نظام الحاقن سهل الاستخدام ويقلل من نفايات العينات. لتحضير البلورات في وسط لزوجة عالية ، قم أولا بالطرد المركزي للمحلول البلوري بسرعة منخفضة لتشكيل حبيبات بلورية ناعمة.

بعد إزالة الوسيط الزائد ، اربط قارنة التوصيل بنهاية حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر وقم بتحميل 28 ميكرولترا من المحلول البلوري في برميل المحقنة. أدخل المكبس ببطء في الجزء العلوي من المحقنة وادفع المحلول برفق إلى نهاية طرف قارنة التوصيل. لإزالة الفقاعات ، استخدم إصبعا واحدا يرتدي قفازا لتطبيق ضغط لطيف جدا على الجزء العلوي من نقطة إبرة قارنة التوصيل المكتظة لإنشاء ختم وسحب المكبس لسحب المحلول بعيدا عن طرف الإبرة لإحداث تراكم للضغط داخل المحقنة ، ثم قم بإزالة الإصبع لتحرير الضغط بسرعة وتفجير أي فقاعات داخل المحقنة.

بدلا من ذلك ، أمسك المحقنة بيد واحدة مع توجيه الإبرة لأعلى والمكبس بين إصبعين وقم بتدوير الذراع الذي يمسك المحقنة في اتجاه واحد مرتين إلى ثلاث مرات. ستجبر قوة الطرد المركزي الناتجة أي فقاعات هواء على الخروج من المحقنة. عند إزالة جميع الفقاعات ، استخدم ملعقة دقيقة لإضافة 42 ميكرولتر من شحم السيليكون عالي التفريغ مباشرة إلى الجزء العلوي من حقنة ثانية سعة 100 ميكرولتر واضغط على المكبس حتى النهاية لإزالة أي فقاعات هواء ولضمان عدم وجود فجوة هوائية في نهاية المحقنة.

عندما تتم إزالة جميع الفقاعات من كلا المحقنتين ، مع تثبيت كلتا المحاقن من الأطراف ، قم بتوصيل المحاقن بقارنة التوصيل. لخلط العينات معا ، قم بالضغط برفق على كل من المحلول البلوري وغطاسات حقنة شحم السيليكون من 50 إلى 100 مرة حتى يتم خلط المواد جيدا وتبدو متجانسة. ثم تصور البلورات تحت المجهر البصري.

لتحديد تركيز البلورات في شحم السيليكون ، احسب عدد البلورات في منطقة معينة باستخدام صور المجهر البصري. لتقليل تركيز البلورة ، كرر تحضير البلورة باستخدام حجم أكبر من شحم السيليكون أو قم بتخفيف الحبيبات البلورية في مخزن مؤقت للبلورة قبل إعداد المحقنة. لزيادة تركيز البلورات ، كرر تحضير البلورة باستخدام كمية أصغر من شحم السيليكون ، مع الحرص على عدم تقليل اللزوجة إلى أقل من 10 ثوان باسكالية.

عندما يتم الحصول على تركيز البلورة المناسب ، انقل العينة بأكملها إلى حقنة واحدة واستبدل المقرنة بإبرة حقن بقطر داخلي 108 ميكرون مثبتة بإحكام شديد في قاعدة المحقنة. لإعداد الحاقن ، حدد الأدوات ووضع التوجيه ومفتاح الحد السالب وابدأ في التوجيه واترك البرنامج يعمل حتى يتم سحب المسمار بشكل كاف لتناسب حقنة 100 ميكرولتر تحت المسمار. أدخل إبرة حقنة فارغة من خلال الشق الموجود في حامل المحقنة لتركيب المحقنة على الحاقن وربط المحقنة على الحامل.

لف حلقة O واحدة عبر الجزء الأوسط من المحقنة ، وقم بربط الحلقة بالخطافات الموجودة على جانبي المحقنة وقم بلف حلقة O ثانية حول الخطافات الموجودة في الجزء العلوي من المحقنة. تأكد من وضع جزء واحد من الحلقة O الثانية أعلى المحقنة الزجاجية. لتحضير عينة المحقنة ، قم بتجهيز المحقنة ، ضع غطاء الحاقن على رأس مكبس الحقنة العينة وقم بتحميل المحقنة على الحاقن.

حرك برغي محرك الأقراص إلى أعلى الغطاء. في برنامج التحكم في الحاقن ، حدد وضع السرعة وقم بتنشيط وضع السرعة. اضبط قيمة الإعداد على 3,000 دورة في الدقيقة وانقر فوق تطبيق قيمة الإعداد.

عندما يقترب المسمار من الغطاء الموجود على رأس مكبس المحقنة ، قم بتغيير قيمة الإعداد إلى الصفر. بمجرد إجراء الاتصال ، انقر فوق تطبيق قيمة الإعداد لتنشيط القيمة المحددة مسبقا ، وإيقاف المسمار على الفور. ثم قم بهز الغطاء برفق للتأكد من ثباته في مكانه.

لتشغيل الحاقن، قم بتغيير قيمة الإعداد إلى 100 دورة في الدقيقة وفحص الطرف بصريا لمراقبة العينة عندما تبدأ في البثق. بعد إغلاق القفص ، قم بتقليل قيمة الإعداد بمقدار 10 حتى يتم ملاحظة تدفق بطيء ولكن مستقر من المواد. إذا لم يتدفق دفق العينة بشكل جيد، فقم بزيادة قيمة الإعداد بزيادات قدرها 10 دورات في الدقيقة حتى يصبح الدفق أكثر استقامة.

إذا لم يستقر التيار، فأدخل ماسك عينة البوليسترين أسفل تيار العينة للمساعدة في توجيه العينة. بدلا من ذلك ، أدخل قمع شفط Venturi في ماسك العينات ، والذي يمكن توصيله بأنبوب مخرج الهواء الموجود في قفص السنكروترون الأسترالي. لتحديد معدل تدفق التيار ، استخدم حاسبة تدفق جهاز Lipidico.

يعد تحديد سرعة تشغيل العينة المثلى للحاقن أمرا بالغ الأهمية لاستقرار التيار. ينتج عن معدل التدفق البطيء تمدد شحم السيليكون المبثق من الحاقن ، بينما ينتج عن معدل التدفق الأسرع تيارا أرق. لوحظ تجعيد تيار الوسائط اللزجة بانتظام.

للتغلب على هذه المشكلة في العينات عالية الشحنة ، يمكن استخدام ماسك البوليسترين لإدخال قوة إلكتروستاتيكية ضعيفة. في هذا التحليل ، تم استخدام حقنة زجاجية تحتوي على 26 ميكرولترا من بلورات الليزوزيم المعلقة في شحم السيليكون. تم جمع كمية كافية من البيانات في غضون 38 دقيقة مما مكن من إنشاء خريطة كثافة الإلكترون المحيطة بروابط ثاني كبريتيد في بنية الليزوزيم.

تذكر استخدام حجم صغير من العينة على الشريحة الزجاجية لتقييم التركيز البلوري للعينة لتحديد ما إذا كانت اللزوجة بحاجة إلى تصحيح. يسمح تعدد استخدامات الحاقن بتوصيف الأشعة السينية للمواد الأخرى عالية اللزوجة. على سبيل المثال ، الهياكل السائلة الأيونية التي تستخدم أبحاث البطاريات أو المواد الغروية باستخدام منتجات الألبان.