استراتيجية من خطوتين تجمع بين التعديل اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات

يجمع البروتوكول الموضح في هذا الفيديو لأول مرة بين استخدام المسح الكيميائي اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية للحث على تعدد القدرات والحفاظ عليه في الخلايا البالغة المتمايزة نهائيا. تكمن القوة الرئيسية لهذا البروتوكول في أنه لا يتطلب نواقل معدلة وراثيا أو فيروسية. علاوة على ذلك ، فهي قوية وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة ومرنة.

لا تتطلب هذه التقنية استخدام تعداء الجينات ، وبالتالي تمثل تقدما تقنيا ملحوظا للطب الانتقالي والعلاج الخلوي ، مع دعم الثقافة طويلة الأمد للخلايا عالية اللدونة. ستظهر الإجراء جورجيا بيناروسا ، الأستاذة المساعدة ، وتيريسينا دي إيوريو ، طالبة الدكتوراه من مختبري. ابدأ بتحضير محلول مخزون 5-aza-CR الطازج سعة ملليمول.

تزن 2.44 ملليغرام من 5-aza-CR وقم بإذابتها في 10 ملليلتر من DMEM مع نسبة عالية من الجلوكوز. أعد تعليق المسحوق عن طريق دوامة وتعقيم المحلول بفلتر 0.22 ميكرومتر. قم بإعداد محلول عمل 5-aza-CR عن طريق تخفيف ميكرولتر واحد من محلول المخزون في مليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا الليفية.

قم بتربسين الخلايا كما هو موضح في المخطوطة النصية وإخراجها بسحب لطيف. ثم اجمع معلق الخلية وانقله إلى أنبوب مخروطي الشكل. عد الخلايا باستخدام غرفة العد تحت المجهر البصري.

الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 150 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات للحصول على 40 ، 000 خلية في 30 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الليفية المكملة بميكرومولار واحد 5-aza-CR. املأ طبق بتري مقاس 35 ملم بمسحوق PTFE لإنتاج سرير وتوزيع 30 ميكرولترا من الخلايا على طبقة المسحوق.

قم بتدوير طبق بتري برفق بحركة دائرية للتأكد من أن مسحوق PTFE يغطي سطح قطرة السائل بالكامل لتشكيل مفاعل حيوي ميكروبي من الرخام السائل. التقط المفاعل الحيوي الميكروبي المصنوع من الرخام السائل باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر تم قطعه لاستيعاب قطر الرخام. ضع المفاعل الحيوي الميكروبي على طبق بتري نظيف للجراثيم لتثبيته.

بعد ذلك ، انقل المفاعل الحيوي الميكروبي من طبق بتري إلى طبق 96 بئرا. أضف ببطء 100 ميكرولتر من الوسائط من هامش البئر. يجب أن يطفو المفاعل الحيوي الميكروبي فوق الوسائط.

احتضان المفاعل الميكروبيولوجي الرخامي السائل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد الحضانة ، اجمع المفاعل الحيوي الميكروبي الرخامي السائل باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر وضعه في طبق بتري جديد للبكتريولوجيا مقاس 35 ملم. استخدم إبرة لثقب الرخام السائل وكسره.

استرجع الكرويات المتكونة بطرف ماصة سعة 200 ميكرولتر تم قطعه عند الحافة تحت مجهر مجسم. لغسل بقايا 5-aza-CR ، انقل العضيات إلى طبق بتري يحتوي على وسط ESC. قم بإعداد طبق بتري جديد مقاس 35 ملم يحتوي على طبقة مسحوق PTFE وقم بتوزيع عضو عضوي واحد في قطرة سعة 30 ميكرولتر من وسط ثقافة ESC على المسحوق باستخدام طرف ماصة مقطوع سعة 200 ميكرولتر.

قم بتدوير الطبق برفق بحركة دائرية لتشكيل مفاعل حيوي رخامي سائل جديد ونقله إلى بئر من 96 بئرا. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط من هامش البئر لغسل الرخام ببطء. استزراع المفاعلات الميكروبيولوجية الرخامية السائلة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

تظهر التحليلات المورفولوجية أنه بعد حضانة لمدة 18 ساعة مع عامل إزالة الميثيل 5-aza-CR ، تم تجميع الخلايا الليفية من ثلاثة أنواع من الثدييات المغلفة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE وتشكيل هياكل كروية ثلاثية الأبعاد بهندسة موحدة الحجم. في ظل ظروف 3D ، قام 86.31٪ من الخلايا المغلفة بتعديل نمطها الظاهري بشكل ملحوظ. في المقابل ، كانت خلايا ما بعد 5-aza-CR المزروعة في ظروف قياسية ثنائية الأبعاد أصغر حجما بكثير ، مع نوى حبيبية واحتفظت بتوزيع أحادي الطبقة.

كانت التغييرات المورفولوجية مصحوبة ببداية التعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، في كل من الخلايا ثلاثية الأبعاد و 2D بعد 5-aza-CR. لوحظ النسخ ل POU من الفئة الخامسة homeobox one ، و NANOG homeobox ، و ZFP42 ، وبروتين إصبع الزنك ZFP42 ، ومنطقة تحديد الجنس Ybox2 ، وهي غائبة في الخلايا الليفية غير المعالجة. كما لوحظ تنظيم كبير لجزيء التصاق الخلايا الظهارية 10-11 المنتقل 2 وجينات الكاديرين 1 في خلايا 3D post-5-aza-CR مقارنة بالخلايا المزروعة في أطباق بلاستيكية قياسية ثنائية الأبعاد.

في موازاة ذلك ، تم الكشف عن تقليل تنظيم مستضد سطح الخلية Thy1 الخاص بالخلايا الليفية في كل من خلايا 3D و 2D بعد 5-aza-CR. تم تأكيد انخفاض كبير في مستويات المثيلة في كل من خلايا 3D و 2D بعد 5-aza-CR باستخدام ELISA. كانت مستويات مثيلة الحمض النووي أقل بشكل ملحوظ في خلايا 3D بعد 5-aza-CR مقارنة بالخلايا المزروعة في ظروف ثنائية الأبعاد.

علاوة على ذلك ، احتفظت خلايا 3D post-5-aza-CR بالهيكل الكروي ثلاثي الأبعاد المكتسب ، ومستويات التعبير العالية للجينات المرتبطة بتعدد القدرات ، ومستويات مثيلة الحمض النووي المنخفضة لمدة 28 يوما ، وعند هذه النقطة تم القبض على الثقافة. يمكن أيضا استخدام المفاعلات الحيوية الدقيقة للحفاظ على الظروف المثلى لمزارع الخلايا السلفية ، وكذلك لتعزيز كفاءة التمايز النهائي.