عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة
يناير 14, 2021
هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا الجرثومية الحية الميوتيك وما بعد الومياء من الخصيات الماوس الكبار. باستخدام السمية الخلوية المنخفضة ، وصبغة ملزمة الحمض النووي ذات الحماس البنفسجي وفرز الخلايا المنشطة بالفلور ، يمكن للمرء عزل مجموعات الخلايا المنوية الغنية للغاية للعديد من تطبيقات المصب.
يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة الجديدة لعزل الاكتظاظ الفرعي لـ spermatocytes و spermatids من الفئران البالغة للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة الكامنة في الداء والحيوانات المنوية. يستخدم هذا الأسلوب صبغة الحمض النووي المنخفضة السمية للخلايا مع طيف واسع من الإثارة التي يمكن تطبيقها على معظم أوامر FACS المستخدمة حاليًا. هذا الأسلوب هو مباشرة جداً.
الجانب الأكثر تحديا هو جات عملية الجاتم للخلايا تدفق ولكن استراتيجية مفصلة الغات ينبغي أن تساعد في تكييف البروتوكول إلى غيرها من فرز الخلايا. ومن بين الاجراءات سيكون يو هان يه مساعد باحث من مختبر ساتوشي تمكاوا. بعد حصاد كل من الخصيتين من فأر ذكر عمره ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في طبق بيتري 60 ملليمترًا يحتوي على ملليلترين من PBS البارد الجليدي وإزالة tunica albuginea.
فصل بلطف الخصيتين مع ملقط لتفريق قليلا الأنابيب seminiferous. ونقل الأنابيب إلى قطرة من الجليد الطازج برنامج تلفزيوني الباردة في طبق بيتري 100 ملليمتر. استخدام ملقط لفك بلطف الأنابيب وغسل الأنابيب في ثلاث قطرات إضافية من برنامج تلفزيوني كما هو موضح للتو.
بعد الغسيل الأخير ، ضع الأنابيب شبه المتحللة في أنبوب 15 ملليلتر ، يحتوي على ميليلترين من عازلة الانفصام لاحتضان لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لميصة بلطف الأنابيب 20 مرة، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة لمدة ست دقائق إضافية. في نهاية الحضانة ، الماصات الأنسجة 20 مرة إضافية ، قبل إعادة الأنبوب إلى الحاضنة.
بعد ثلاث دقائق، الماصات بلطف الأنابيب 10 مرات أو حتى لا تبقى قطع الأنسجة مرئية، قبل وقف تفكك مع 10 ملليلتر من عازلة FACS. ثم، الطرد المركزي إلى تعليق الأنسجة مرتين باستخدام 10 ملليلتر إضافية لمخزن FACS الطازجة لغسل الثانية لإزالة الحيوانات المنوية والحطام أكبر قدر ممكن. لطخة الخلايا لتحليل تدفق cytometric، إعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من العازلة FACS.
وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية النايلون 70 ميكرون، في أنبوب 50 ملليلتر. بعد العد، نقل 10٪ من الخلايا إلى أنبوب جديد على الجليد كتحكم سلبي غير مقع. وخلط دقيق ستة microliters من وصمة عار DCV في تعليق الخلية المتبقية.
بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في الظلام مع اهتزاز لطيف كل 10 دقائق، إضافة خمسة ميكرولترات من DNase الأول إلى الخلايا. وتصفية الخلايا من خلال 35 ميكرون مصفاة شبكة النايلون في أنبوب FACS خمسة ملليلتر على الجليد. لتحليل تدفق الخلايا السيتوميترية، قم بإنشاء تجربة جديدة في برنامج تحليل التدفق، وتحت قائمة أدوات ورقة العمل، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام مقابل رسم كثافة المنطقة على مقياس خطي.
انقر فوق مدرج التكراري الجديد لإنشاء رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس لوغاريتمي. وانقر فوق ابدأ وسجل لبدء معالجة عينة غير الملطخة. أثناء تشغيل العينة، انقر فوق كشف وإعدادات العتبة لضبط كل من الفولتية PMT مبعثرة إلى الأمام والجانب لوضع الخلايا غير المطّلعة على مقياس المؤامرة مبعثر إلى الأمام والخلف.
ضبط الجهد PMT لقناة jappy لتحديد موقع السكان السلبي DCV في العقد الأول من مؤامرة DCV الرسم البياني الأزرق لوغاريتمي. ثم انقر فوق إيقاف لإلغاء تحميل نموذج غير المُطَعَى. بعد دوامة لفترة وجيزة وتحميل العينة الملطخة، انقر فوق أنبوب المقبل لإنشاء ورقة عمل جديدة للعينة.
تعيين مقياس السيتا للحصول على ما لا يقل عن واحد مرات 10 للأحداث الستة، وانقر فوق ابدأ وسجل. بعد ذلك، انقر فوق كثافة جديدة لإنشاء ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل عرض التشتت الأمامي. وDCV الأزرق مقابل DCV الحمراء كثافة المؤامرات على مقياس خطي.
على منطقة التشتت الأمامية مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية، استخدم أداة المضلع لرسم بوابة تسمى الخلايا لتشمل معظم الخلايا واستبعاد الحطام الصغير. تطبيق هذه البوابة إلى ارتفاع مبعثر إلى الأمام مقابل رسم عرض مبعثر إلى الأمام واستخدام أداة المستطيل لرسم بوابة خلية واحدة لاستبعاد الخلايا المفردة غير. تطبيق بوابة الخلية المفردة على مخطط الكثافة اللون الأزرق DCV مقابل DCV وضبط المقياس لالتقاط ملف تعريف موسع.
استخدم أداة المضلع لرسم بوابة DCV لاستبعاد الخلايا غير المُطَفَقة وفئات الجانب، وتطبيق البوابة على رسم مدرج التكراري الأزرق DCV على مقياس خطي. تشير القمم الرئيسية الثلاث إلى محتويات الحمض النووي المختلفة 1C و 2C و 4C. إنشاء الأزرق DCV الثاني مقابل مؤامرة DCV الكثافة الحمراء على مقياس خطي.
وبوابة العودة بوابة DCV على المؤامرة لتحديد موقع السكان 1C و 4C. إنشاء الأزرق DCV آخر مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. واستخدام أداة القطع الناقص لرسم بوابة على السكان 1C.
استخدام أداة المضلع لبوابة السكان 4C مع منحنى مستمر. وخلق آخر DCV الأزرق مقابل مؤامرة الكثافة الحمراء DCV على مقياس خطي. استخدام أداة المضلع لإنشاء بوابة واحدة 4C.
في مؤامرة جديدة إلى الأمام إلى جانب مبعثر، واستخدام أداة القطع الناقص لإنشاء pachytene، diplotene واللبيتوتين، وبوابات zygotene spermatocyte. عندما تم رسم جميع البوابات ، قم بإنشاء DCV الأزرق الجديد مقابل مؤامرة نقطة اللون الأحمر DCV على مقياس خطي لتطبيق بوابة 4C لضمان أن السكان الثلاثة في ترتيب مستمر داخل البوابة. بعد ذلك، قم بإنشاء منطقة جديدة للأمام مبعثر مقابل مؤامرة كثافة المنطقة الخلفية على مقياس خطي، وحدد الحجم الموحد للخلايا كسكان من الحيوانات المنوية المستديرة النقية.
بعد الفرز، و purities ممثل من اللبوتين المنفصلة، zygotene، pachytene وdelotene كسور الحيوانات المنوية وعادة ما تكون بين 80٪ إلى 90٪كما أكد SYCP3 وغاما H2AX المناعة. ويمكن تأكيد نقاء فصيل الحيوانات المنوية جولة من نواة تلطيخ مع DCV في تركيبة مع Sp56 وH1t تلطيخ، وأيضا عادة حول 90٪ قابلية بقاء مجموعات الخلايا المعزولة عادة ما تكون أكثر من 95٪، ومتوسط الغلة الإجمالية لكل جزء من فأرة الكبار واحد عادة ما تكون كافية لتحليل المصب المختلفة. يمكن استخدام الخلايا المفرزة لتحليل تسلسل الجيل التالي المتنوع لاستكشاف التعبير الجيني والتنظيم أثناء تكوين الحيوانات المنوية بشكل أفضل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة مباشرة لعزل الخلايا الجرثومية الحية في مرحلتي الانقسام الاختزالي وما بعد الانقسام الاختزالي من خصى الفئران البالغة. وباستخدام صبغة رابطة للحمض النووي DNA ذات سمية منخفضة وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات خلايا منوية عالية الإثراء لاستخدامها في تطبيقات متنوعة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا التناسلية
خلفية علمية
- يعد عزل الخلايا المكونة للنطاف أمراً بالغ الأهمية لدراسة الانقسام الاختزالي وتكون النطاف.
- قد تتضمن الطرق الحالية سمية خلوية عالية، مما يحد من حيوية الخلايا.
- تهدف هذه الطريقة إلى تحسين حيوية الخلايا أثناء عملية العزل.
- يعد تحديد البوابات في قياس التدفق الخلوي خطوة حرجة في هذه العملية.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول فعال لعزل الخلايا المنوية والطلائع المنوية.
- تسهيل استقصاء الآليات الجزيئية في الانقسام المنصف.
- توفير استراتيجية تقسيم تفصيلية (gating strategy) لتكييف البروتوكول مع أجهزة فرز الخلايا الأخرى.
الطرق المستخدمة
- حصاد الخصيتين من ذكور الفئران البالغة.
- استخدام صبغة لربط الـ DNA منخفضة السمية الخلوية وتُثار بالضوء البنفسجي.
- توظيف تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS).
- تنفيذ استراتيجية مفصلة لتحديد البوابات (gating strategy) في قياس التدفق الخلوي.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للخلايا الجرثومية الحية في مرحلتي الانقسام الاختزالي وما بعد الانقسام الاختزالي.
- إثراء عالٍ لمجتمعات الخلايا المكونة للنطاف.
- إثبات إمكانية تطبيق هذه الطريقة على أنظمة FACS المختلفة.
- توفير بروتوكول مباشر وبسيط للباحثين.
الاستنتاجات
- تعمل هذه الطريقة على تعزيز حيوية الخلايا الجرثومية المعزولة.
- توفر هذه الطريقة أداة قيمة لدراسة عملية تكوين الحيوانات المنوية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية استقصاء العوامل الجينية والجينية الفوقية في الانقسام الاختزالي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح عزل المجموعات الفرعية الحية من الخلايا المكونة للنطاف تقليل المخاطر الميكانيكية للأهداف في البيولوجيا التناسلية والاكتشاف العلاجي الذي يستهدف الخط الجرثومي. وتدعم هذه الطريقة الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال توفير خلايا حية عالية النقاء للاختبارات الوظيفية والتحليلات الأومية اللاحقة. كما أن توافقها مع منصات FACS القياسية التي تعمل بالليزر البنفسجي يحسن من إمكانية الوصول وقابلية التوسع عبر تدفقات عمل الاكتشاف.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية في مسارات الانقسام الاختزالي وتكوين الحيوانات المنوية باستخدام كسور منقية من الخلايا المنوية في مراحل leptotene/zygotene، وpachytene، وdiplotene.
- القيمة التشغيلية: توفر نهج صبغ منخفض السمية الخلوية ومتوافق مع أجهزة فرز الخلايا بالليزر البنفسجي المتوفرة على نطاق واسع، مما يقلل من العوائق المتعلقة بالمعدات.
- القيمة العلمية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال عزل خلايا حية بنسبة حيوية تزيد عن 95% لإجراء المتابعة الوظيفية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر قراءات كمية لمحتوى DNA (1C، 2C، 4C) عبر تلوين DCV، مما يتيح تحديد بوابات (gating) معيارية بناءً على مستوى التضاعف الصبغي لضمان تكرارية الاختبار.
- القيمة التشغيلية: يسهل تحضير معلقات الخلايا المفردة من الخصى الفئرانية، وهي خطوة تمهيدية حاسمة لسلاسل تدفق الفرز الخلوي (FACS) الخاصة بالفحص.
- القيمة العلمية: ينتج أجزاءً عالية النقاء من الطلائع المنوية (spermatid) والخلايا المنوية (spermatocyte) (بدرجة نقاء 80–90%)، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات اللاحقة المتسقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-seq).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لدراسة المنظمات الجينية وفوق الجينية للانقسام الاختزالي، مما يدعم المواءمة بين الهدف والفرضية.
- القيمة التشغيلية: يتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال توفير خلايا جرثومية قابلة للحياة للدراسات الميكانيكية.
- القيمة العلمية: يدعم قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التحقق من أهداف الخط الجرثومي.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، لا سيما في العلاجات التي تعدل الخط الجرثومي حيث يكون السياق الخلوي أمراً بالغ الأهمية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات عن طريق عزل مراحل انقسام منصفة محددة للتوصيف الجزيئي.
- الفحص: تُمكّن من جاهزية المقايسة من خلال بروتوكولات تفكيك وتلوين موحدة تنتج جودة متسقة من المعلقات الخلوية.
- التحليلات: توفر قراءات كمية مفصلة حسب مستوى التعدد الصبغي عبر فلورة DCV، مما يسمح بمقارنة الحالات الخلوية عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط العمل بالدراسات قبل السريرية من خلال توفير نظام نموذج فأري ذي صلة انتقالية بعملية تكوين الحيوانات المنوية لدى البشر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لسير عمل متوافق مع تقنية FACS وقابل لإعادة الاستخدام لعزل الخلايا الجرثومية الحية عبر مشاريع وفئات مستهدفة متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال الوضوح الميكانيكي في التقدم الانقسامي المنصف.
- القيمة التشغيلية: التقييس وقابلية التكرار عبر استراتيجية بوابية مفصلة واستخدام صبغة ذات سمية خلوية منخفضة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج أهداف التكاثر.
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأهداف الخط الجرثومي بناءً على التحقق الوظيفي في مجموعات فرعية من الخلايا المنقاة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تحديد البوابات (gating) وتعويض الفلورة (fluorescence compensation) لتقنية قياس التدفق الخلوي من أجل تحليل DCV متعدد المعلمات.
- يعتمد على توفر أجهزة FACS ذات قدرة تحفيز بليزر بنفسجي (405 nm).
- يستلزم توحيد معايير تفكيك الأنسجة وتوقيت الصبغ بين مختلف المشغلين والمختبرات.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة نماذج أخرى تحسين محلول التفكيك وظروف الحضن.
- قيد عملي: تم التحقق من صحة الطريقة حالياً في خصيتي الفئران البالغة؛ وتتطلب إمكانية تطبيقها على الأنسجة غير الناضجة أو البشرية مزيداً من البحث.
