الأبقار المبيض القشرة الأنسجة الثقافة

يسمح هذا البروتوكول بإجراء فحص متعمق في المختبر للبيئة المجهرية للمبيض. تمكين المستخدمين من تحديد نمو المسام والتنمية، فضلا عن توليد الستيرويد ووفرة من جزيئات المناعة. إحدى مزايا هذه التقنية هي القدرة على تقييم التغيرات في البيئة المجهرية المبيضية والجريبات الناشئة وتقييم التفاعل الفريد الناجم عن إضافة هرمونات محددة.

يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة مجموعة متنوعة من الاضطرابات الإنجابية التي تسبب الاعتقالات الجريبية. على سبيل المثال، متلازمة المبيض المتعدد الكيسات. بما أننا نستطيع تقييم البيئة المجهرية المبيض مباشرة في المختبر، مما يدل على الإجراء سيكون بروك بيل، باحث الجامعية من مختبري.

باستخدام ملقط الفك cerated، وتأمين المبيض، شريحة في النصف، والبدء في إزالة شرائح الخارجي. ضمان قطع ما لا يزيد عن عمق سطح من 1 إلى 2 ملليمتر بعيدا عن المبيض بحيث لا يتم جمع النخاع. قطع ثلاثة إلى أربعة شرائط رقيقة من قشرة المبيض مع مشرط ووضع شرائط في برنامج تلفزيوني الثالث شغل طبق بيتري.

قطع الشرائط إلى قطع مربعة صغيرة من 0.5 إلى ملليمتر مكعب واحد مع شفرة مشرط. استخدام مسطرة تحت أطباق بيتري لضمان القطع هي من حجم مماثل وسمك لجعل قطع قشرة المبيض متسقة. غسل قطع المبيض القشرية في جميع PBS الثلاثة والمضادات الحيوية حقل أطباق بيتري، وذلك باستخدام ملقط تلميح المنحني لنقل القطع بين يغسل.

نقل قطع القشرة من خلال سلسلة من يغسل LB-15 ووضعها في طبق بيتري LB-15 مليئة النهائي. تسمية الغطاء مع هوية الحيوان والجانب المبيض. جمع أربع قطع قشرة المبيض لكل المبيض وإصلاحها ليوم صفر الأنسجة وتجميد قطع إضافية لتنقية الحمض النووي الريبي.

استخدام قطع الأنسجة المتبقية للثقافة. إعداد خزانة السلامة البيولوجية لغسل الأنسجة النهائي وإعداد الثقافة. تعقيم الإمدادات مع 70٪ الإيثانول قبل وضعها في خزانة السلامة البيولوجية.

نقل جميع قطع قشرة المبيض المخصصة للثقافة إلى خزانة السلامة البيولوجية وغسلها مرة أخرى في طبق بيتري مملوءة LB-15. ماصة 350 ميكرولتر من وايموث المتوسطة لكل بئر في لوحة زراعة الأنسجة 24 بئر. وضع الثقافة غير المصقولة إدراج جيدا في كل بئر باستخدام ملقط التأكد من أن يتم تشكيل أي فقاعات تحت قاعدة إدراج.

وضع بعناية وبدقة أربع قطع قشرة المبيض على شبكة من كل إدراج دون ثقب شبكة. احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تغيير ثقافة قشرة المبيض المتوسطة يوميا لمدة سبعة أيام مع التأكد من استخدام المتوسطة وايموث قبل الحارة.

خلال التغييرات المتوسطة، استخدم ملقط لرفع إدراج بلطف من البئر وجمع المتوسطة وايموث مثقف في أنابيب 0.5 ملليلتر. تعيين إدراج مرة أخرى في البئر وإضافة 350 ميكرولتر من الثقافة الطازجة المتوسطة عن طريق الاستغناء عنه بين جانب إدراج وبخير. تخزين المتوسطة التي تم جمعها من زراعة الأنسجة في ناقص 20 درجة مئوية.

بعد سبعة أيام من الثقافة، صور قطع قشرة المبيض باستخدام مجهر تشريح مع كاميرا مرفقة وبرنامج تصوير الكمبيوتر. إصلاح قطعتين قشرة المبيض لكل بئر في حل بوين لعلم الأنسجة وتجميد فلاش لقطع قشرة المبيض في النيتروجين السائل للحصول على الحمض النووي الريبي لcDNA. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار مع الأنسجة ثم جمع المتوسطة من اليوم السابع وتخزينها ناقص 20 درجة.

السماح لقطع قشرة المبيض بالبقاء مغمورة في محلول بوين لمدة 1.5 ساعة تقريبا ، ثم غسلها بالإيثانول بنسبة 70٪ ثلاث مرات ، والحفاظ على الأنسجة في الإيثانول بنسبة 70٪ ومسحها يوميا حتى لا يعود المحلول أصفر. تم إجراء وصمة عار هيماتوكسيلين واليوسين لبصيلات بدائية، بصيلات الأولية في وقت مبكر، بصيلات الأولية، بصيلات الثانوية وبصيلات أنترال. تم إجراء التدريج الجريب على قشرة المبيض ثابتة قبل وبعد الثقافة لتقييم تولد الجريبات.

الفرق في مورفولوجيا كما يحددها ترسب الكولاجين يمكن أن تشير إلى التليف في قشرة المبيض من درج الخطوة أو السيطرة على heifers. تظهر هنا مقارنة لمتوسط مساحة التلطيخ الإيجابي الأحمر picrosirius لكل قشرة المبيض المليئة بين التحكم وهايفر خطوة الدرج. تم تجميع المجموعة اليومية من الثقافة المتوسطة على مدى ثلاثة أيام لتقييم إنتاج هرمون الستيرويد المتنوعة, باستخدام radioimmunoassay.

كما تم قياس الأيض الستيرويد وإنتاج السيتوكين في المتوسط ثقافة قشرة المبيض من بئر واحد لكل تجمع على مدى أربعة أيام من الثقافة. كلما طالت مدة جلوس الأنسجة، كلما كان العمل معها أصعب. قد تحتاج إلى ممارسة تخفيضات دقيقة.

وتستخدم هذه التقنية لفهم الآثار على مسارات نقل إشارة لإنقاذ ستيرويدوجينيسيس الزائدة لتحديد آثار المنشطات الزائدة على إنتاج السيتوكين والكيموكين, وتحديد الآثار على تطور المسام أو الاعتقال داخل أنسجة المبيض.