عزل الملتحمة والهوية في الفئران

تحدد هذه الطريقة الكائنات الدقيقة الملتحمة العينية القابلة للتطبيق ، والتي تشكل تحديا بسبب بيئة العينين العدائية. يمكن أن يساعد في الإجابة عما إذا كان يوجد ميكروبيوم العين وكيف يتغير الوجود البكتيري في مرض العين. وعلى النقيض من تسلسل الحمض النووي، الذي يحدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة وغير القابلة للحياة على حد سواء، فإن هذه الطريقة تحدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة فقط، مما يؤدي إلى فهم أوضح لمجتمع كومنسال العين.

تشير الدراسات إلى أنه من الصعب تشخيص أمراض العين مثل عدم المناعة الذاتية وجفاف العين المناعية الذاتية لها وجود بكتيري عين فريد. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشخيص أمراض العين مع التوقيعات الميكروبية المميزة. تبدأ عن طريق autoclaving الكمية المناسبة من القطن الضرب ومسواك لعدد الفئران التي سيتم مسحها، ثم قرصة قبالة قطعة طويلة سنتيمتر واحد من الضرب القطن وندف بها عن طريق سحب على حواف لتشكيل طبقة واحدة مسطحة مسامية وقف قبل الضرب ينهار.

دوامة الضرب حول واحدة من النهايات الحادة للمسنك عن طريق عقد طفيفة قطعة امتدت على طرف مسواك كما هو الملتوية. مسحة العين النهائية سيكون لها طبقة رقيقة جدا من القطن امتدت على طرف تمتد ما يقرب من 1/2 إلى سنتيمتر واحد بعيدا عن الطرف. إدراج مسحات في كوب صغير، مسحة الجانب إلى أسفل ثم تغطية وautclave لهم.

تنظيف منطقة العمل مع مطهر للحد من التلوث وaliquot 0.5 ملليلتر من ضخ قلب الدماغ العقيمة، أو وسائل الإعلام BHI في المسمى 1.5 ملليلتر أنابيب الطرد المركزي الصغيرة العقيمة. قم بوضع الأنابيب في رف ووضع الرف على الجليد. إعداد سير العمل من اليسار إلى اليمين بدءا من محطة تخدير الماوس، والذي يحتوي على القفص مع الفئران التجريبية، قفص عقيم فارغ، تخدير درجة حرارة الغرفة، إبرة قياس 25 وحقنة ملليلتر واحد.

بعد ذلك ، قم بإعداد محطة مسح العين التي تحتوي على BHI المقتبس على الجليد ، ومسحات العين المعقمة ، وقطرات العين التشحيم ، وحاوية المخاطر البيولوجية ، والمناشف الورقية النظيفة ، ورذاذ الأيزوبروبانول بنسبة 70٪. وأخيرا، قم بإعداد محطة الطلاء مع لوحات أجار الدم درجة حرارة الغرفة، ماصة 10 ميكرولتر، 10 نصائح الميكرولتر القابل للتصرف العقيمة، وحاوية النفايات الخطرة بيولوجيا. تأكد من أن يتم تخدير الماوس بشكل صحيح عن طريق الضغط على لوحة القدم الخلفية.

فقط المضي قدما إذا لم يكن هناك حركة. تعيين يد واحدة للتعامل مع الفئران تخدير والأيدي الأخرى للتعامل مع مسحة العين والثقافة. إزالة الماوس من القفص ووضعه على رأس سطح العمل المتمركزة على جانبها مع العين اليسرى المكشوفة.

رش اليدين القفازين مع الأيزوبروبانول وجففها بمنشفة ورقية. فك أنبوب الطرد المركزي الصغير BHI المسمى مع يد معالجة الوسائط المخصصة ووضع الاثنين مرة أخرى في الحامل. تراجع طرف القطن المغلفة من مسحة العين في BHI، ثم سحب مسحة من الأنبوب في حين يحوم الطرف مرتين ضد الأنبوب الداخلي لإزالة السائل الزائد وإزالتها.

مع يد الماوس التعامل مع، عقد بلطف الماوس من قبل scruff من الرقبة. مع اليد الأخرى، ضع طرف مسحة العين ضد المنطقة الملتحمة الوسيطة للعين اليسرى. الاكتئاب طفيفة مقلة العين وتحريك مسحة في نافذة غسل الحركة بين الجفن السفلي والعين 10 مرات، والحفاظ على الضغط المستمر.

دون لمس الفراء، وإزالة بلطف غيض من مسحة عمودي إلى حيث تم إدراجها. ضع جانب القطن المسحة لأسفل ، مباشرة في أنبوب طرد مركزي صغير مع وسائط BHI. ضعي قطرة عين على العين المسحة.

إذا رغبت في ذلك، والحصول على مسحات الجلد أو الفراء لعينات التحكم، وتعقيم قفازات بشكل مناسب بين كل مسحة. عند الانتهاء، أعد الماوس إلى القفص. دع المسحة تقف لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد ، ثم تعقيم اليدين القفازتين وإزالة المسحة أثناء خلط الطرف في الوسائط لمدة 10 دورات.

سحب مسحة عن طريق تدوير طرف ضد الجدار الداخلي للأنبوب لمدة خمس دورات والتخلص منه في حاوية المخاطر البيولوجية. كرر العملية لكل ماوس. إثراء العينة عن طريق احتضان الأنبوب بشكل ثابت لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

أثناء الحضانة، تسمية لوحة TSA درجة حرارة غرفة واحدة لكل مسحة عين الماوس أو مسحة التحكم وتقسيمها إلى نصفين. إزالة عينات المخصب من الحاضنة ووضعها على الجليد. دوامة لفترة وجيزة العينات لخلط، ثم aliquot 10 ميكرولتر من العينة على لوحة TSA وإمالة لوحة لتشكيل قطاع.

كرر هذا مرتين. على الجانب الآخر من الخط الفاصل لوحات، وخلق 10 نقاط مع 10 ميكرولتر من عينة لكل منهما. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة، يومين وأربعة أيام في غرفة نظيفة تمنع لوحات أجار من التجفيف.

عد المستعمرات في الشرائط. لاحظ مورفولوجيا وحساب وحدات تشكيل مستعمرة لكل مسحة لعزلات مماثلة شكليا. انظر إلى النقاط التي لا يتم فيها التقاط كائنات فريدة في الشرائط.

لتسهيل التصور، قمنا بطلاء البكتيريا بكثافة في الصفائح الوسطى والأيسر. عادة، لاحظنا بكتيريا أقل بكثير في لوحات مسحة العين. لاحظ أنه في بعض الأحيان ، قد لا تسفر مسحات العين عن بكتيريا قابلة للاسترداد.

تظهر هنا لوحة مسحة عين تمثيلية مع عزلات متنوعة شكليا من فأر أسود من C57. لكل عزلة متميزة، تم عد المستعمرات في القطاع وتم حساب الوفرة النسبية ورسمها. لتوصيف الميكروبيولوجية، تم انتقاؤها البكتيريا من لوحات مسحة عين الفأر الفردية لإنتاج لوحة TSA الرئيسية.

عندما ظهر النمو، تم إجراء اختبارات إضافية لتوصيف أو تحديد الميكروبات. تم استخدام اللوحة الرئيسية لتوفير ما يكفي من inoculum لتوسيع العزلات المعنية. ولتحديد العزلات، تم تناثر لوحة TSA واحتضانها بين عشية وضحاها، وتم إجراء مرض التصلب المتعدد MALDI-TOF.

تم تحديد أمثلة من العزلات الموضحة هنا باسم المكورات العقدية اسيدومينيموس وإيروكوكوس viridans. تم استرداد مستويات مختلفة بشكل ملحوظ من الكائنات العضوية من الذكور والإناث C57 الأسود ستة فئران. تم عزل المكورات العقدية اسيدومينيموس، Aerococcus viridans تخثر المكورات العنقودية السلبية وE.coli من C57 الأسود ستة N الفئران.

عند محاولة هذا البروتوكول، نضع في اعتبارنا أن أفضل نتيجة سوف تتحقق عن طريق طلاء مسحة رقيقة وأخذ الوقت خلال خطوة مسحة العين. إذا كان الوصول إلى مرض التصلب العصبي المتعدد MALDI-TOF محدودا، فيمكن تحديد العزلات عن طريق الاختبارات الميكروبيولوجية والكيميائية الحيوية.