زرع رقعة مطبوعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد في نموذج مورين من احتشاء عضلة القلب
سبتمبر 26, 2020
يهدف هذا البروتوكول إلى زرع رقعة مطبوعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد على epicardium من الفئران المهجوعة التي تقوم بالنمذجة لفشل القلب. وهو يتضمن تفاصيل تتعلق التخدير, فتح الصدر الجراحية, الربط الدائم من اليسار المنحدرة (LAD) الشريان التاجي وتطبيق التصحيح مطبوعة بيولوجيا على المنطقة الزراعية من القلب.
كل 10 دقائق شخص ما في أستراليا لديه نوبة قلبية هذا يمكن أن يترك لهم مع عضلة القلب التالفة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى فشل القلب. لقد وجدنا أنه يمكننا تحويل الخلايا الجذعية، من الدم أو الجلد، إلى خلايا القلب النابضة.
ثم، إذا وضعنا هذه الخلايا التي أعيد برمجتها، من خلال الطابع الحيوي 3D لدينا، وذلك باستخدام bioink، ونحن نعتقد أننا يمكن أن تجعل بقع القلب مع خلايا مطابقة الخلايا الخاصة الناس. يتم احضان فأر تخدير عميق، باستخدام الكيتامين زيلازين، باستخدام قسطرة قياس 20. بعد النوب من تعقب، يتم وضع الماوس بعناية على وسادة التدفئة، ثم متصلا بجهاز التنفس الصناعي الذي يحدد تلقائيا الحجم المستهدف على أساس وزن الماوس.
تحت التخدير الخفيف باستخدام 2٪ iso فلوريد، الماوس فقط نظيفة مع اليود والإيثانول. يتم تنفيذ استئصال الصدر الجانبي الأيسر لفضح القلب. يوضع الدارع بين الضلع الثالث والضلع الرابع.
يتم قطع الميكاروم بعناية. تم التعرف على LAD تحت المجهر. بالنسبة لخطوة ربط LAD ، من المهم تجنب قطع الغرز من خلال LAD.
لذلك، يتم وضع قطعة معززة من خياطة الحرير 3.06 على القلب كما هو مبين، تشغيل في نفس الاتجاه وفقط على رأس LAD. باستخدام خياطة الحرير 7.06، يتم عزل LAD وربطها بشكل دائم. وهذا يسمح تبييض القلب الذي يتلقى نوبة قلبية.
وهذا سيؤدي إلى إعادة عرض والبطين الأيسر سوف تفشل مع مرور الوقت. يتم إنشاء رقعة قلب ثلاثية الأبعاد مطبوعة بيولوجيًا في المختبر باستخدام مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد. وهذا يسمح طبقة بطبقة، ترسب الخلايا القلبية، وذلك باستخدام مزيج من الخلايا والهيدروجيل.
يمكنك أن ترى واحدة عائمة في هذا الفيديو والآن في هذه الصورة. هنا هو صورة من مظهر التصحيح عندما صورت من قبل المجهر ضوء epifluorescence في بئر من لوحة ستة بئر. وقد لطخت التصحيح مع وصمة عار Hoechst لnuclei الخلية، وهذه البقعة الزرقاء هو تسليط الضوء أيضا على هيدروجيلس autofluorescent.
هذا هو تصحيح الجيلاتين algenate سليمة مناسبة لزرع، على غرار تلك التي تظهر في الفيديو. مع طريقتنا ، بدأت معظم البقع تتفكك بين 14 و 28 يومًا ، في الثقافة ، كما هو موضح هنا في هذه الصورة من رقعة أخرى ، والتي تفككت. وجدنا أن الوقت الأمثل لزرع بقع كان بين اليوم السابع واليوم 14 بعد الطباعة الحيوية.
وكان هذا عندما بدأت البقع التي تحتوي على خلايا القلب للفوز، مما يدل على درجة من نضج الأنسجة، ولكن قبل بقع بدأت تتفكك. يتم إحضارها التصحيح إلى غرفة العمليات الجراحية، وببطء وبعناية وضعت على رأس القلب في جزء من الماوس. يتم نقل بعناية أيضا إلى منطقة الاستدلال.
تتم إزالة المناقل ببطء. وأخيراً، يتم إغلاق الأضلاع الثالثة والرابعة معاً باستخدام خياطة برولين 6.0. جنبا إلى جنب مع العضلات، يتم إغلاق الأضلاع، تليها إغلاق الجلد.
بعد إغلاق الصدر ، يتم حقن الماوس مع Antisedan وfurosemide. ببطء، سوف الماوس استعادة نشاط التنفس مستقلة، وسوف تستجيب لقرصة إصبع. يتم رصد الماوس عن كثب ، وبمجرد أن يستيقظ من التخدير ، يتم وضعه في قفص الخاصة به.
تظهر هذه الصورة ، مع المنطقة المعتمدة ، حيث ستجلس التصحيح المطبوعة بيولوجيًا فوق قلب الماوس. في الختام، لقد أظهرنا أن 3D bioprinted الجلاتين بقع الجيلاتين يمكن زرعها من طريقتنا، على epicardium، في نموذج الماوس من احتشاء عضلة القلب. في مرحلة الطباعة الحيوية ، يكون للجيلات الهراتية هيدروجيلات قابلية طباعة ممتازة بسبب خصائصها الريولوجية ، مما يسمح للبثق دون تلف الخلايا ، ولكن أيضًا وجود القوة الميكانيكية الحيوية للاحتفاظ بهيكلها بعد الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، وأثناء الزراعة.
ومن المرجح أن تكون لدينا طريقة ممكنة على نطاق واسع ومناسبة أيضا لاختبار مجموعات متعددة من بقع 3D مطبوعة بيولوجيا. على سبيل المثال، مع محتويات الخلوية المختلفة.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لزراعة رقعة مطبوعة حيوياً ثلاثية الأبعاد على نخاب القلب لدى فئران مصابة باحتشاء عضلة القلب، وذلك لمحاكاة فشل القلب. تتضمن الطريقة خطوات جراحية مفصلة واستخدام رقع مطبوعة حيوياً مكونة من خلايا قلبية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- هندسة الأنسجة القلبية
- الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد
- نماذج احتشاء عضلة القلب
خلفية علمية
- يمكن أن تؤدي النوبات القلبية إلى تلف عضلة القلب وفشل القلب.
- يمكن إعادة برمجة الخلايا الجذعية لتحويلها إلى خلايا قلب نابضة.
- تتيح الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد إنشاء رقع قلبية باستخدام الحبر الحيوي.
- يعد التوقيت الأمثل لزراعة الرقعة أمراً حاسماً لتحقيق النجاح.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لزراعة رقع قلب مطبوعة حيوياً.
- تقييم جدوى استخدام خلايا مطابقة للمريض لإنشاء الرقع.
- تقييم فعالية الرقع في نموذج فأر مصاب باحتشاء عضلة القلب.
الطرق المستخدمة
- استخدام الكيتامين والكسيلازين للتخدير في الفئران.
- إجراء عملية بضع الصدر الجانبي الأيسر للكشف عن القلب.
- الربط الدائم للشريان التاجي الأيسر النازل الأمامي.
- زراعة رقع مطبوعة حيوياً ثلاثية الأبعاد على القلب.
النتائج الرئيسية
- أظهرت الرقع المطبوعة حيوياً ثلاثية الأبعاد قابلية جيدة للطباعة وقوة ميكانيكية حيوية.
- بدأت الرقع في التحلل بين اليوم 14 واليوم 28 من الاستزراع.
- حدثت عملية الزرع المثلى بين اليوم 7 واليوم 14 بعد الطباعة الحيوية.
- تعد هذه الطريقة مناسبة لاختبار تركيبات مختلفة من الرقع المطبوعة حيوياً.
الاستنتاجات
- يمكن زراعة رقع الألجينات والجيلاتين المطبوعة حيوياً ثلاثية الأبعاد بنجاح.
- من المرجح أن تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع في أبحاث القلب.
- يمكن للدراسات المستقبلية استكشاف محتويات خلوية مختلفة لتحقيق نتائج محسنة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتناول هذا البروتوكول عقبة حرجة في أبحاث تجديد القلب: وهي الاختبار الموثوق في الجسم الحي للرقع العلاجية المطبوعة حيوياً ثلاثية الأبعاد في نماذج احتشاء عضلة القلب لدى الفئران. ومن خلال تقليل التباين الإجرائي ومعدلات الوفيات المرتبطة بالزراعة الجراحية، يتيح هذا البروتوكول تقييماً قبل سريري أكثر قوة من الناحية الإحصائية للأنسجة المهندسة. ويدعم هذا التقدم تقليل المخاطر المرتبطة بالمواد البيولوجية والمواد الحيوية في مراحلها المبكرة من خلال تحسين قابلية التكرار في دراسات التحقق الوظيفي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح التقييم الوظيفي للرقع المطبوعة حيوياً في بيئة مجهرية نقص تروية ذات صلة بالمرض للتحقق من الفرضيات الميكانيكية لاندماج الأنسجة والإشارات المجاورة.
- القيمة التشغيلية: توحد طريقة التوصيل الجراحي للمواد البيولوجية المعقدة، مما يقلل من التباين بين الحيوانات في كفاءة الاندماج.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توفر منصة قابلة للتكرار لمقارنة تركيبات الرقع (مثل أنواع الخلايا، ونسب الهيدروجيل) بناءً على مقاييس الاحتفاظ الهيكلي والتكامل.
- القيمة التشغيلية: تدعم الفحص متوسط الإنتاجية للمواد الحيوية المرشحة من خلال تمكين توصيل جراحي متسق عبر مجموعات الدراسة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يسهل التقييم الطولي لإعادة تشكيل البطين والتعافي الوظيفي بوساطة الرقاعة في نموذج ذو صلة سريرياً للإصابة بنقص التروية.
- القيمة التشغيلية: يتيح إجراء دراسات ذات قوة إحصائية مع تقليل معدلات الفقد، مما يحسن من جدوى تجارب الاستجابة للجرعة وتحسين التوقيت.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
تندرج هذه الطريقة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، من خلال تمكين التوصيل الموحد للأنسجة المهندسة بعد التحقق من الهدف وقبل فحص الفعالية في نماذج الأمراض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة ببقاء الخلايا، والاندماج الخلوي، وإفراز العوامل النشطة بيولوجياً في عضلة القلب المصابة بالاحتشاء.
- الفحص: تتيح المقارنة الكمية لتصاميم الرقع من خلال عمليات الزرع الجراحي الموحدة والمراقبة بعد الزرع.
- التحليلات: تولد قراءات نسيجية مرضية ووظيفية (مثل حجم الاحتشاء، وسماكة الجدار) لتقييم أداء الرقع وتصنيفها.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين مقاييس النضج في المختبر (in vitro) والنتائج الوظيفية في الجسم الحي (in vivo) لتوجيه قرارات المضي قدماً أو التوقف.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة جراحية قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم مختلف مرشحات تجديد القلب عبر مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تحسين الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال تقليل المتغيرات الجراحية المربكة.
- القيمة التشغيلية: تعزيز إمكانية تكرار وتوسيع نطاق إجراءات نقل الأنسجة المعقدة.
- القيمة الاستراتيجية: تقليل الضوضاء البيولوجية في تقييمات الفعالية، مما يدعم اتخاذ قرارات أكثر وضوحاً بشأن المضي قدماً أو التوقف في مراحل التطوير المبكرة.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمرشحي تجديد القلب بناءً على بيانات قبل سريرية أكثر موثوقية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في جراحة القلب للفئران، والتخدير، والرعاية ما بعد الجراحة.
- يعتمد على توفر أدوات الخياطة الدقيقة، وأجهزة التنفس الاصطناعي، والمجاهر الستريو (stereomicroscopes) لإجراء ربط دقيق للشريان التاجي الأيسر النازل (LAD).
- يستلزم توحيد بروتوكولات التعامل مع الرقعة وتحديد موضعها بين جميع المشغلين.
- يجب مراعاة التباين في توقيت نضوج الرقعة بناءً على مصدر الخلايا وتكوين الهيدروجيل (hydrogel).
- يقتصر على نماذج الإصابة الحادة وشبه الحادة؛ ولا يصلح لدراسات نقص التروية المزمن دون تكييف النموذج.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
