Ex Vivo Choroid فحص من تكوين الأوعية الأوعية الدموية الدقيقة
أغسطس 6, 2020
يقدم هذا البروتوكول مقايسة المشيمية التي تنبت ، وهو نموذج سابق vivo للانتشار الأوعية الدموية الدقيقة. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم المسارات التي تشارك في انتشار الأوعية الدقيقة المشيمية وتقييم العلاجات الدوائية باستخدام النوع البري وأنسجة الفئران المعدلة وراثياً.
هذا الاختبار المشيمية قابل للتكرار بدرجة كبيرة ووثيق الصلة بأبحاث تكوين الأوعية المشيمية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر ، AMD يمكن أن يكمل في الجسم الحي دراسات سلوك الأوعية الدموية الدقيقة. يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص المركبات كعلاجات محتملة ل AMD الوعائي الجديد أو لتقييم المسارات المشاركة في التوسع العصبي العصبي المشيمي باستخدام النوع البري وأنسجة الفأر المعدلة وراثيا. للبدء ، أضف خمسة ملليلتر من البنسلين والستربتومايسين و 10 وخمسة ملليلتر من المكملات الغذائية المتوفرة تجاريا إلى 500 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل مع المصل ثم قم بإضافة 50 مل من المتوسط لإذابة مستخلص الغشاء القاعدي أو BME طوال الليل في الثلاجة عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
ضع كمية من الوسط الكلاسيكي الكامل على الجليد. نظف المجهر والملقط والمقص باستخدام 70٪ من الإيثانول. استعد لأطباق زراعة الخلايا ووضع أحدها على مجهر التشريح والآخر على الثلج.
ثم أضف 10 مل من الوسط الكلاسيكي الكامل إلى كل طبق. حافظ على العينين في وسط كلاسيكي كامل على الجليد قبل التشريح. قم بإزالة النسيج الضام والعصب البصري ثم استخدم مقصا صغيرا لقطع محيطي بمقدار 0.5 ملم خلف ليمبوس القرنية.
قم بإزالة مركب القرنية القزحية والجسم الزجاجي والعدسة. قم بعمل شق بحجم ملليمتر واحد عموديا على الحافة المقطوعة باتجاه العصب البصري ولقطع نطاق محيطي بعرض ملليمتر واحد ثم افصل بين المناطق المركزية والطرفية للمجمع. استخدم ملقطا لتقشير شبكية العين من مركب الصلبة المشيمية RPE.
احتفظ بشريط المشيمية المحيطي في وسط كلاسيكي كامل على الجليد. اعزل العين الأخرى وكرر العملية لقطع شريط ثان. قطع الشريط الدائري إلى خمس إلى ست قطع مربعة متساوية تقريبا.
أضف 30 ميكرولترا من BME المذاب في وسط كل بئر من لوحة زراعة أنسجة 24 جيدا. تأكد من أن قطرة BME تشكل قبة محدبة في الجزء السفلي من اللوحة دون لمس الحواف. ضع الأنسجة في منتصف BME.
لا تقم بتسطيح نبات المشيمية X. دع الأنسجة تتوسع داخل BME. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للسماح للهلام بالتصلب ثم أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكلاسيكي الكامل في كل بئر.
قم بتغيير الوسيط الكلاسيكي كل يومين. يمكن ملاحظة تنبت المشيمية بعد ثلاثة أيام بالمجهر. افتح صورة المشيمية التي تنبت بالصورة J وتحقق من الصورة واكتب وثمانية بت بمقياس رمادي.
ثم قم بتحسين التباين عن طريق تحديد الصورة وضبطها وتباين السطوع وضبطها. استخدم وظيفة العصا السحرية لتحديد وإزالة الأنسجة المشيمية الموجودة في وسط البراعم. قم بإزالة خلفية الصورة باستخدام أدوات التحديد المجانية.
بعد ذلك ، انتقل إلى الصورة ، واضبط العتبة ، واستخدم وظيفة العتبة لتحديد براعم الأوعية الدموية الدقيقة على الخلفية في المحيط. انقر فوق F2 وسيظهر ملخص. انقر فوق حفظ لحفظ صورة للمنطقة المحددة في نفس المجلد مثل الصورة الأصلية للرجوع إليها في المستقبل.
بعد قياس مجموعة من العينات ، انسخ البيانات المسجلة للتحليل. تم استخدام هذا البروتوكول لفحص وتحديد كمية تنبت المشيمية في C 57 ، ستة فئران سوداء J من اليوم الثالث إلى اليوم السادس. في حالة تمثيلية ، كانت مساحة الإنبات المشيمية 0.38 و 1.47 و 5.62 و 10.09 ملم مربع في الأيام الثالثة والرابع والخامس والسادس على التوالي.
تم تقييم آثار فقدان FFAR4 على إنبات الأوعية الدموية المشيمية باستخدام مقايسة تنبت المشيمية في FFAR4 أربعة فئران من النوع البري FFAR4. زادت منطقة الإنبات في الفئران بالضربة القاضية FFAR4 من نمو الأوعية الدموية المشيمية مقارنة بالنوع البري FFAR4 في اليوم السادس. علاوة على ذلك ، قلل العلاج بناهض FFAR4 ميكرومولار واحد من منطقة الإنبات المشيمية مقارنة بالفئران غير المعالجة في اليوم السادس.
يسمح هذا الاختبار بالتقييم القابل للتكرار للإمكانات المضادة لتولد الأوعية للمركبات الدوائية وتباين دور مسارات معينة في إعادة الأوعية الدموية المشيمية باستخدام أنسجة الفئران المعدلة وراثيا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول اختبار تبرعم المشيمية كنموذج خارج الجسم (ex vivo) لدراسة التكاثر الوعائي الدقيق، وتحديداً فيما يتعلق بتكوّن الأوعية الدموية في المشيمية والتنكس البقعي المرتبط بالسن (AMD) الوعائي. يتيح هذا الاختبار تقييم المسارات المشاركة في تكاثر الأوعية الدموية الدقيقة في المشيمية وتقييم العلاجات الدوائية باستخدام أنسجة الفئران من النوع البري والمعدلة وراثياً.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- تكون الأوعية الدموية المشيمية
- التنكس البقعي المرتبط بالسن (AMD)
- سلوك الأوعية الدموية الدقيقة
خلفية علمية
- أهمية تكوّن الأوعية الدموية المشيمية في أمراض العين
- النماذج خارج الجسم التي تكمل الدراسات داخل الجسم
- نماذج الفئران المعدلة وراثياً لتعزيز الرؤى العلمية
الطرق المستخدمة
- مقايسة تبرعم المشيمية
- استخدام أنسجة الفئران من سلالات النوع البري والسلالات المعدلة وراثيًا
- المجهرية لمراقبة تبرعم المشيمية
النتائج الرئيسية
- يسمح هذا الاختبار بإجراء قياسات قابلة للتكرار للتبرعم المشيمي على مدار عدة أيام
- أدى فقدان FFAR4 في الفئران التي تعاني من تعطيل الجين إلى زيادة نمو الأوعية الدموية المشيمية مقارنة بالنوع البري
- أدى العلاج باستخدام محفز FFAR4 إلى تقليل مساحة التبرعم المشيمي في الفئران التي تعاني من تعطيل الجين
الاستنتاجات
- تثبت الدراسة فعالية المقايسة في تقييم القدرة المضادة لتكوّن الأوعية الدموية للمركبات الدوائية
- وتسلط الضوء على دور مسارات تأشير محددة في تكوّن الأوعية الدموية الجديدة في المشيمية
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يوفر مقايسة تبرعم المشيمية خارج الجسم نموذجاً قابلاً للتكرار لتقييم تكاثر الأوعية الدموية الدقيقة في المشيمية، وهو أمر ذو صلة مباشرة باكتشاف الأدوية لعلاج التنكس البقعي المرتبط بالسن (AMD) المصحوب بتكون أوعية دموية جديدة. وتتيح هذه المقايسة تقليل المخاطر الميكانيكية لمسارات تولد الأوعية باستخدام أنسجة الفئران من النوع البري والمعدلة وراثياً، مما يدعم التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة في خطوط تطوير أدوية طب العيون. وتعمل المقايسة كجسر بين بيولوجيا الاكتشاف والتقييم قبل السريري من خلال قياس ديناميكيات التبرعم في نظام مستنبت نسيجي ذي صلة فسيولوجية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس التبرعم المشيمي استجابةً للتعديل الجيني أو الدوائي لمسارات تكوين الأوعية الدموية.
- القيمة التشغيلية: تتيح التحقق الوظيفي من أهداف مثل FFAR4 في سياق نسيجي متعدد الخلايا يشمل البطانة، والبلاعم، والبيريسيتات، وظهارة صبغة الشبكية (RPE).
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة الأدوية من خلال قياس التأثيرات المعتمدة على الجرعة للمركبات على التبرعم الوعائي الدقيق بمرور الوقت.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج قراءات كمية قائمة على التصوير لمساحة التبرعم، والتي تعكس تكوين الشبكة الوعائية الدقيقة في ظل ظروف محكومة.
- القيمة التشغيلية: يستخدم زراعة المستأصلات الموحدة في BME منخفض عوامل النمو مع جداول محددة لتغيير الوسط لضمان تكرار النتائج عبر التجارب.
- القابلية للتوسع: يتوافق مع تنسيق أطباق 24-well والتحليل شبه الآلي باستخدام ImageJ لفحص المركبات بإنتاجية متوسطة إلى عالية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على البنية الأصلية للمشيمية والظهارة الصبغية للشبكية والصلبة، مما يحفظ التفاعلات بين الخلايا الضرورية لنمذجة تكوين الأوعية الدموية المرضي.
- القيمة التشغيلية: يسمح بالمقارنة المباشرة بين الأنسجة من النوع البري والأنسجة المعطلة جينياً (مثل FFAR4) لعزل المساهمات الجينية في أنماط التبرعم.
- القيمة التنبؤية: يُمكّن من تقييم تأثيرات المحفزات والمثبطات على التبرعم، مما يوفر أدلة قبل سريرية لتعديل المسار.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب هذا المقاييس ضمن سلسلة اكتشافات طب العيون، بدءاً من التحقق من الهدف، مروراً بتحسين المركبات الرائدة، وصولاً إلى اختبارات الفعالية قبل السريرية، لا سيما فيما يتعلق باستراتيجيات مضادات تكوين الأوعية الدموية في حالات التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD).
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمنظمات تكوين الأوعية الدموية من خلال قياس التغيرات في التبرعم استجابةً لتثبيط أو تنشيط المسارات.
- الفحص: يوفر مقاييس كمية وقابلة للتكرار للتبرعم تتيح ترتيب تأثيرات المركبات تصاعدياً أو تنازلياً في تنسيق قائم على الأنسجة.
- التحليلات: يوفر قياسات قائمة على المساحة ومحددة زمنياً (على سبيل المثال، من اليوم 3 إلى اليوم 6) تدعم التحليل الحركي للاستجابات الوعائية الدقيقة.
- الأبحاث الانتقالية: يستخدم مستأصلات ذات صلة بالمرض لنمذجة التوعي الجديد في المشيمية، مما يسهل الاستقراء إلى نماذج التنكس البقعي المرتبط بالسن (AMD) في الجسم الحي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة موحدة وقابلة لإعادة الاستخدام لتقييم مركبات متعددة أو نماذج جينية عبر مشاريع مختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال ربط الاضطرابات الجينية أو الدوائية بنتائج التبرعم القابلة للقياس الكمي في سياق نسيجي أصلي.
- القيمة التشغيلية: يضمن قابلية التكرار من خلال توحيد بروتوكولات عزل الأنسجة، والزراعة على BME، وتغيير الوسط، والتصوير.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف (go/no-go) من خلال تقديم أدلة مبكرة قائمة على الأنسجة حول النشاط المضاد لتكون الأوعية الدموية قبل الاختبارات الحيوية (in vivo).
- تأثير المحفظة: يتيح تحديد أولويات المركبات بناءً على تعديل المخاطر استناداً إلى بيانات الاستجابة للجرعة والتحقق الجيني.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشريح الأنسجة الفأرية وعزل المستنبتات تحت ظروف معقمة.
- يعتمد على توفر مستخلص الغشاء القاعدي المخفض لعوامل النمو (BME) ومجهر تباين الطور.
- يستلزم وجود سير عمل موحد لتحليل الصور (مثل ماكرو ImageJ) لضمان اتساق قياسات التبرعم.
- يجب مراعاة التباين في حجم المستنبت وحيوية الأنسجة عند تفسير مقاييس التبرعم.
- يقتصر على الأنسجة الفأرية؛ وقد تؤثر الاختلافات بين الأنواع على إمكانية تطبيق النتائج على بيولوجيا المشيمية البشرية.
