تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

SM FISH بدقة مستويات توطين RNase معين. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتحليل الخلية إلى الخلية والأليل عن طريق تباين الأليل في الحمض النووي الريبي. يعد نسخ الجينات عملية أساسية في بيولوجيا الخلية ، ويسمح SM FISH بالتحقيق في محتوى الحمض النووي الريبي استجابة للمنبهات الخارجية على مستوى الخلية المفردة وتوفير المعلومات المكانية.

بعد العلاج بناهض مستقبلات هرمون الاستروجين ، اغسل الخلايا باستخدام PBS المعقم البارد مع الكالسيوم والمغنيسيوم وقم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت لمدة 30 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المعقم البارد مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة ثلاث دقائق قبل إضافة 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول إلى كل بئر. ثم أغلق الصفيحة المكونة من 24 بئر بغشاء بلاستيكي من البارافين وضع اللوحة على محور دوار عند أربع درجات مئوية لمدة أربع درجات مئوية على الأقل وحتى 16 ساعة.

بالنسبة لتهجين RNA FISH ، في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من 2X SSC المؤقت المكمل ب 10٪ فورماميد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على المدور. أثناء الحضانة ، ضع قطعة من فيلم بارفين البلاستيكي غير المكشوف لأعلى في طبق بتري زجاجي يتم تنظيفه بسطح الحمض النووي الريبي لإزالة التطهير وضعه في مناشف ورقية معقمة مشبعة بالماء على طول حواف الطبق. في نهاية الحضانة ، ضع 30 قطرة ميكرولتر متباعدة بشكل متساو من المخزن المؤقت الطازج للمسبار GREB1 intron و GREB1 exon على الجانب النظيف من فيلم البارافين البلاستيكي واستخدم ملقطا معقما لوضع غطاء واحد برفق من جانب الخلية الخلوية لأسفل على كل قطرة بدون فقاعات.

بعد إغلاق الطبق بغشاء بلاستيكي من البارافين ، قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم واحتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية على سطح مستو غير دوار. في صباح اليوم التالي ، استخدم الملقط لإعادة زلات الغطاء إلى جانب خلية لوحة 24 جيدا لأعلى لمدة غسلتين لمدة 15 دقيقة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2X SSC الطازج المكمل ب 10٪ فورماميد لكل غسلة عند 37 درجة مئوية على دوار ساخن. بعد الغسيل الثاني ، قم بتلطيخ الحمض النووي بميكروغرام واحد لكل مليلتر من DAPI في مخزن مؤقت 2X SSC لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على دوار متبوعا بغسل لمدة خمس دقائق في 2X SSC المؤقت في درجة حرارة الغرفة.

استخدم منشفة ورقية لإزالة المخزن المؤقت الزائد 2X SSC وشطف العينات بماء خال من النوكلياز للتخلص من الأملاح الزائدة. ثم استخدم وسيط تثبيت غير صلب لتركيب زلات الغطاء على شرائح زجاجية وإغلاق زلات الغطاء بطلاء أظافر شفاف. لتصوير العينة ، قم بتحميل الشريحة بأعلى كثافة متوقعة على مرحلة مجهر متألق واسع النطاق مزود بهدف زيت 60 أو 100 مرة في كاميرا sCOMS وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف.

للحصول على Zstack ، ركز على العينة في قناة DAPI وحدد الجزء العلوي والسفلي من Zstack على المسافات التي تصبح فيها النوى الملطخة ب DAPI خارج نطاق التركيز. استخدم الشريحة لتحسين مقدار الإضاءة من مصدر الضوء وأوقات التعريض الضوئي لكل قناة والحصول على صور من جميع الشرائح في ظل ظروف تتجنب تبييض الصور أو تشبع بكسل الكاميرا. بعد الاستحواذ ، استخدم 10 دورات من خوارزمية تصالحية عدوانية لفك التلفيق للصور وحفظ جميع صور الإسقاط وفقا لعمق بت الكاميرا المستخدمة.

لتحليل الصور ، قم أولا بتنزيل Jupiter Notebook من GitHub وقم بتثبيت الإصدار 3.6 من Python Anaconda Distribution أو أعلى. افتح موجه Anaconda وأدخل أمر التثبيت لتثبيت SimpleITK ل Anaconda. افتح Anaconda Navigator وقم بتشغيل Jupiter Notebook.

سيتم فتح متصفح ويب لعرض الدلائل والملفات. استعرض هياكل الدليل للوصول إلى الدليل الذي يحتوي على Jupiter Notebook الذي تم تنزيله من GitHub. ثم افتح دفتر الملاحظات واضغط على Shift وEnter لتشغيل كل خلية.

في هذه التجربة التمثيلية ، عولجت خلايا سرطان الثدي الملتصقة بناهض مستقبلات هرمون الاستروجين ، أو مركبة ، لمدة 24 ساعة. سمحت مجموعات المسبار المنفصلة طيفيا مقابل التسلسلات الداخلية والأجنبية GREB1 بالتصور والقياس الكمي المتزامن ل mRNA الناشئ والناضج. الأهم من ذلك ، يمكن تحديد عدد الأليلات النشطة النسخ في كل خلية والتي ثبت أنها جزء من دورة وقت استجابة هرمون الاستروجين.

من خلال حساب بقع الإنترون والإكسون المتداخلة ، تم تحديد الخلايا المعالجة ب E2 لتكون تحتوي على جزء متزايد بأربعة أضعاف من الخلايا التي تظهر أليلين نشطين أو أكثر من GREB1 مقارنة بالخلايا المعالجة بالمركبة. نظرا لأن الإنترونات يتم تقسيمها من mRNA الناشئ لإنتاج mRNA ناضج يتكون من تسلسلات exon فقط ، يمكن حساب عدد mRNA الناضج لكل خلية عن طريق تحديد عدد البقع الخضراء. يسمح رسم هذه البيانات بعد ذلك بالتحول في توزيع خلية GREB1 mRNA الناضجة وتغيير الطية الإجمالية في مجموعة الخلايا بعد علاج E2.

يسمح C-FISH بالتحقيق في أنواع متعددة من الحمض النووي الريبي بالتتابع ، وMERFISH هي تقنية تشفير شريطي لزيادة تعدد الإرسال بشكل كبير ، ويستخدم iFISH لدراسة الحمض النووي الريبي والبروتينات في وقت واحد.