تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

هناك مقاربات مختلفة للتبلور للحصول على بلورات كبيرة وعالية الجودة لكل من الأشعة السينية والبلورات النيوترونية. واحدة من هذه الطرق هو استخدام طريقة غسيل الكلى. في هذه التقنية ، يتم فصل محلول البروتين عن محلول متهور بواسطة غشاء شبه نفاذي.

الجزيئات المتعجلة تنتشر عبر الغشاء في غرفة البروتين. عندما يتم تحقيق التشبع الفائق الصحيح للنية العفوية ، ستظهر النواة الأولى. هنا، سوف نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا تستخدم تبلور غسيل الكلى الخاضع للرقابة في درجة الحرارة، وأزرار غسيل الكلى الجزئي الخاصة بنا لزراعة بلورات عالية الجودة كبيرة لبلورات الجزيئات الجزئية الطبيعية استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.

لزر غسيل الكلى الكلي مع بعض الماصات حجم ميكروليت 35 ميكرولترات من حل lysozyme في غرفة غسيل الكلى. هذا الحجم الإضافي يخلق شكل قبة قليلا على رأس غرفة غسيل الكلى ويمنع تشكيل فقاعة الهواء. تأخذ قضيب ووضع مرونة أو حلقة في أقصى منه.

ضع الغشاء فوق الغرفة واصلحه عن طريق نقل المرونة أو الخاتم من قضيب إلى أخدود زر غسيل الكلى. نقل الزر إلى البئر الذي يحتوي على حل التبلور. غطي البئر بزلة غلاف زجاجي أو قطعة من الشريط.

احتفظ بالعينة عند 293 كلفن في حاضنة تنظيمية حرارية مجانية للاهتزاز. مع العلم أن تبلور غسيل الكلى يوفر مزايا من وجهة نظر النمو البلورية تم تصميم مقاعد التبلور ما يسمى OptiCrys وتطويرها في مختبرنا لتقديم التحكم المدمجة بالكامل من درجة الحرارة والتركيب الكيميائي للتبلور الجزيئي الحيوي التجربة. ويستند تحسين النمو البلورية من قبل OptiCrys على الرسم البياني مرحلة تركيز درجة الحرارة.

تحدث النوى في منطقة التنو في المنطقة المجاورة للمنطقة الفوقية ونمو البلورات ثم تحدث في منطقة الفوقا بعد الرسم التخطيطي للمرحلة، حتى يصل تركيز البروتين إلى منحنى القابلية للذوبان الذي يمثل التوازن الديناميكي الحراري بين الحل والبلورات. عن طريق خفض درجة الحرارة في حالة وجود البروتين مع الذوبان المباشر أو عن طريق زيادة تركيز حاد في حالة من التململ الوصول، ويبقى حل التبلور في منطقة ميتاسيبل ولا تحدث نوات. بلورات تنمو حتى تحقيق التوازن حل الكريستال الثاني وبعد ذلك، لا توجد زيادة أخرى في حجم بلورات لوحظ.

يتم تكرار خفض درجة الحرارة أو زيادة التركيز المتعجل عدة مرات حتى تصل البلورات إلى الحجم المطلوب. إضافة محلول البروتين إلى غرفة غسيل الكلى من درجة الحرارة التي تسيطر عليها تتدفق اقامة، وتغطية أكثر من غرفة مع غشاء غسيل الكلى وإصلاح الغشاء مع مرونة أو حلقة. اقلب الغرفة فوق وضعه على أعلى غرفة غسيل الكلى.

اضغط عليه بلطف وببطء لإزالة كل الهواء المحاصرين بين قطعتين، وإصلاح الخزان في وضع انها عن طريق الشد بلطف على رأس الغرفة أكثر. إضافة محلول التبلور إلى غرفة الخزان وتغطيته بغطاء محكم. نقل هذه الجمعية وإدراجها في دعم الثدي من تبلور OptiCrys كريستال النمو هو برنامج الإشراف على OptiCrys تبلور مقاعد البدلاء.

وهو يتضمن أربعة واجهات رسومية مختلفة أو طرق العرض. تحتوي طريقة العرض الرئيسية على أزرار للانتقال إلى طرق العرض الأخرى. الغرض من واجهة الإعداد هو تعريف سيناريو تجربة يمكن تشغيلها تلقائياً في طريقة عرض الاختبار.

آخر طريقة عرض هي طريقة العرض الصيانة. لإعادة تشغيل تجربة، يجب أن تكون طريقة العرض الصيانة مفتوحة حيث يتم العثور على كافة المعلمات الأساسية لتشغيل السلس قبالة تجارب التبلور. زيادة اللمعان من قسم الضوء، يمكن للضوء زيادة من الصفر، لا ضوء إلى 100 الحد الأقصى للسطوع.

للتحكم في درجة الحرارة ومراقبتها، يتم استخدام قسم تنظيم درجة الحرارة. انقر على الزر لتشغيله. تعيين درجة الحرارة على قسم نقطة مجموعة واضغط على إدخال.

أسفل هذا الزر، هناك رسمان بيانيان. ويظهر الأحمر النهائي ودرجة الحرارة في النظام والرسم البياني الأصفر درجة الحرارة الحالية. خلط حلول المخزون، يتم التحكم في حقن محلول التبلور لغرفة الخزان من قبل قسم النخيل.

إضافة تركيز من حل الأسهم في المرحلة الأولى. ثم العثور على التركيز النهائي لكل حل جديد grouper وإضافتها إلى قسم التركيز النهائي. بعد الضغط على زر حساب، ومعرفة حجم الأسهم حل سيتم حساب وسوف تضيف في لوحة حجم أمام كل لوحة تركيز.

اضغط على زر إعداد التشغيل وانتظر حتى يصبح الحل الجديد جاهزًا. لتبادل حل التبلور، انقر على زر إدخال الحل. لإيقاف العملية، اضغط الزر إيقاف التوزيع.

على الجانب الأيمن من قسم المجهر، وهناك العديد من الألواح لتسجيل المعلومات الهامة من كل تجربة نمو البلورات. إضافة اسم البروتينات المقابلة، الوزن الجزيئي وحالة التبلور في هذا القسم. حدد اسمًا للتجارب عن طريق كتابته على اسم المجلد.

من قسم الصور NB، حدد عدد الصور التي يجب التقاطها أثناء التجربة. إضافة عدد من الصور ومن لوحة على اليمين، واختيار مقياس الموقت. انقر على زر المجلد لفتح المجلد.

يوجد في هذا المجلد ملف نصي يحتوي على كافة المعلومات التي قمت بتعريفها مسبقًا للتجربة. يتم حفظ الصور الجاهزة لأي علاج آخر في هذا المجلد. يمكن أيضا أن تتنوع التكبير قبالة المجهر تلقائيا.

تغيير التكبير باستخدام زائد وناقص الزر في الجزء العلوي من قسم المجهر لزيادة أو إنقاص التكبير على التوالي. هناك ثلاث طرق مختلفة لقياس حجم الكريستال. لقياس الطول أو العرض استخدام ناقلات العرض.

اعتمادا على شكل الكريستال، يمكن اختيار أدوات محددة من الجزء الأيسر من قسم المجهر. مثل مستطيلة أو مضلعة. ستظهر القيم في قسم القياس.

في المجموعة الأولى من التجارب، كانت أزرار التحليل الدقيق مغمورة في حلول التبلور مع تركيزات ملح مختلفة. في هذه التجربة شبكة التبلور بسيطة، المتغير الوحيد هو التركيز المتعجل. بينما تبقى درجة الحرارة ثابتة.

تسمح التغيرات الطفيفة في تركيز الملح بالتحري في مخطط مرحلة التبلور عن طريق زيادة تركيز الملح من 0.7 إلى 1.2 زيادة التشبع البير اللابر والعث، ويبتعد الحل في منطقة النوى عن منطقة الفوقا. وبالتالي ، لوحظ اختلاف في حجم وعدد البلورات مع زيادة عدد البلورات وتتناقص حجمها. في التجربة الأولى مع OptiCrys تحت شرط تجريبي معين، مرة واحدة في التوازن في غرفة غسيل الكلى تصل، حل التبلور هو في منطقة نوات في محيط المنطقة metastable من الرسم البياني مرحلة التبلور.

ونتيجة لذلك، يتم توليد عدد قليل من النوى خلال المرحلة الأولى من التجربة. من أجل الحفاظ على نمو البلورات في منطقة ميتاستابل والسيطرة على عملية نمو البلورات، تم تغيير درجة الحرارة في فترات زمنية مختلفة. في كل مرة تم الانتهاء من توازن حل الكريستال، كانت درجة الحرارة متنوعة.

لذلك انخفضت درجة الحرارة إلى 291 كلفن، 288 كلفن وأخيرا 275 كلفن للحفاظ على نمو البلورة المحددة في منطقة metastable. نتيجة هذه التجربة هي بلورة كبيرة واحدة، مع الحجم المطلوب للبلورات الجزيئية الطبيعية. وتبين تجربتان تاليتان عكسية تجارب غسيل الكلى التي تسيطر عليها درجة الحرارة من أجل النوى ونمو البلورات والذوبان وإعادة النمو.

في التجربة الثانية مع OptiCrys تم الحفاظ على التركيب الكيميائي لمحلول التبلور ثابتًا من خلال التجربة وتباينت درجة الحرارة. تم تعيين درجة الحرارة الأولية في 291 كلفن. بسبب ارتفاع التشبع الفائق ، ظهر عدد كبير من البلورات الصغيرة في غرفة التبلور.

وفقا لمفهوم من بروتين مباشرة ذوبانية, بزّاوج تدريجيّا الدرجة حرارة إلى 313 [كلفنّلّكلّسّيّوّلّو]. وأخيرا، من خلال خفض درجة الحرارة إلى 295 كلفن، بدأت نوات الثاني في محيط المنطقة الفوقية وسمح للسيطرة على عملية النوى مما أدى إلى تشكيل عدد أقل من النوى. سمح المزيد من النمو الكريستال توليد السكان موحدة من بلورات أكبر.

في هذه التجربة، يؤدي تغيير التركيب الكيميائي لمحلول التبلور في درجة حرارة ثابتة إلى الحصول على عدد موحد من البلورات الأكبر. كانت حالة التبلور مشابهة للتجربة السابقة. تم تحقيق حل البلورات عن طريق خفض تركيز NaCl تدريجيا من 0.9 اضحة إلى صفر.

يقلل من تركيز الملح يحافظ على الحل في المنطقة غير المشبعة من الرسم البياني للمرحلة مما يؤدي إلى ذوبان البلورات. ثم تم حقن محلول التبلور الجديد بقوة أيونية أقل من السابق في غرفة الخزان. في هذا التركيز المتعجل يظهر عدد أقل من البلورات وتصل البلورات إلى حجم أكبر من ذي قبل.

هنا قدمنا بروتوكول مفصل يصف إعداد العينة وضبط برامج التحكم لزراعة بلورات كبيرة وعالية الجودة للبلورات الجزيئية الطبيعية باستخدام أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا. تم تصميم هذا الإجراء خطوة بخطوة والاستفادة من معرفة الرسم البياني مرحلة التبلور من أجل فصل نوات ونمو البلورات. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم بروتوكول لزراعة البلورات مع أنماط ميكروسيتسيس أيضا باستخدام أزرار macrocytosis كبديل عندما OptiCrys غير متوفر.

بالإضافة إلى الاستراتيجيات التي ذكرتها ل OptiCrys تغيير التركيب الكيميائي لمحلول التبلور ودرجة الحرارة وأخذ الصور يجب أن يتم يدويا. استخدام الاهتزاز الحراري المنظم حاضنة للحفاظ على درجة الحرارة ثابتة مطلوب، وهو خطوة حاسمة في المنهجية أظهرت.