عزل السوائل القريبة للتحقيق في البيئة الدقيقة للورم من سرطان البنكرياس الغدي
نوفمبر 5, 2020
عصير البنكرياس هو مصدر ثمين للمؤشرات الحيوية لسرطان البنكرياس البشري. نصف هنا طريقة لإجراء الجمع أثناء الجراحة. للتغلب على التحدي المتمثل في اعتماد هذا الإجراء في نماذج الفئران ، نقترح عينة بديلة ، السائل الخلالي للورم ، ونصف هنا بروتوكولين لعزله.
تطبيق الطريقة الموضحة هنا لعزل السائل القريب في كل من الإنسان والفئران لدراسة البيئة المكروية لسرطان البنكرياس لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للمرض. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، من الممكن ترجمة النتائج السريرية من عصير البنكرياس إلى نماذج الفئران من PDAC لإجراء دراسات ميكانيكية. عصير البنكرياس هو سائل جسم غير مستكشف إلى حد كبير وقد أظهر نتائج واعدة كمصدر للمؤشرات الحيوية الثمينة للمساعدة في التشخيص قبل الجراحة وتوصيف المريض.
سأعرض الجزء الأول من البروتوكول ، وستقوم Marialuisa Barbagallo ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبرنا ، بعرض الجزء الثاني من البروتوكول. تقدير موقع قناة البنكرياس باستخدام القياسات المكتسبة أثناء التصوير. ثم تحسس السطح الأمامي للبنكرياس لتحديد موقعه الدقيق.
أمسك رأس البنكرياس في الاثني عشر من الأسفل ، وارفعه باليد اليسرى ، مع تحديد موقع قناة البنكرياس بالرقم الأول. استخدم اليد اليمنى لإدخال حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بإبرة قياس 25 في البنكرياس ، بعيدا عن الإبهام الأيسر. حدد عمق الاختراق ودرجة ميل الإبرة بناء على قياسات ما قبل الجراحة ، وعلى إدراك اختراق جدار القناة.
اسحب العصير بالمحقنة. إذا لم يكن من الممكن استرداد العصير ، فقم بنقل الإبرة في محاولة لقنية قناة البنكرياس. بمجرد استرداد عصير البنكرياس ، انقله خارج الحقل المعقم ، وانقله إلى أنبوب اختبار مفرغ EDTA سعة ثلاثة ملليلتر.
احتفظ بالأنبوب عند أربع درجات مئوية حتى يتم نقل العينة إلى المختبر. لمعالجة عصير البنكرياس ، قم بالطرد المركزي على حرارة 400 جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة أي خلايا أو حطام. استرجع المادة الطافية ، وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليلات.
لعزل السائل الخلالي للورم أو TIF ، عن طريق الطرد المركزي ، قم بقطع الورم إلى نصفين ، واشطف الجزأين في PBS ، وامسحهما برفق على ورق الترشيح ، مع التحرك بأسرع ما يمكن لتجنب التبخر من الورم. انقل الورم على الفور إلى مصفاة خلايا نايلون 20 ميكرومتر ، مثبتة على أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 400 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
استرجع TIF من قاع الأنبوب ، ثم قم بتقسيسه وتجميده على الفور على الثلج الجاف. يحفظ على حرارة 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل. لعزل TIF باستخدام الشطف ، قم بتقطيع الورم إلى قطع صغيرة بمقص أو مشرط ، واشطفها بعناية باستخدام PBS البارد.
انقل قطع الورم إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر ، وأضف 500 ميكرولتر من PBS مع كوكتيل مثبط البروتياز لتجنب تدهور التحليلات. احتضان الأنسجة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بإجراء سلسلة من خطوات الطرد المركزي عند أربع درجات مئوية لإزالة أي خلايا من العينة.
استعادة المادة الطافية بعد كل طرد مركزي ونقلها إلى أنبوب جديد. بعد الطرد المركزي الأخير ، قم على الفور بتجميد عينة TIF على الثلج الجاف. قم بتخزينه على حرارة 80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
تم استخدام هذا البروتوكول للحصول على عصير البنكرياس من المرضى الذين يعانون من PDAC وأمراض البنكرياس الحميدة الأخرى. بعد تصفية إشارات الرنين المغناطيسي النووي الواسعة للجزيئات الكبيرة ، كانت الإشارات من مستقلبات الوزن الجزيئي الصغيرة واضحة. أظهر تحليل OPLS-DA الخاضع للإشراف أن ملف التمثيل الغذائي في عصير البنكرياس كان قادرا على التمييز بين مرضى PDAC وغير PDAC بدقة 82.4٪ ومن المثير للاهتمام أن التحليل الأيضي الذي تم إجراؤه على عينات البلازما من نفس المرضى ، لم ينتج عنه نفس القوة التمييزية.
لإثبات أن محتوى السائل الخلالي للورم يعكس بشكل موثوق التغيرات في البيئة المكروية للورم ، تم حقن خطين من خلايا سرطان البنكرياس بمعدلات تحلل سكر معاكسة تحت الجلد في الفئران. بعد استئصال الأورام ، تم تحديد تركيزات الجلوكوز واللاكتات. احتوى السائل الخلالي للورم من الأورام عالية الحالة للسكر على نسبة أقل من الجلوكوز والمزيد من اللاكتات مقارنة بالأورام منخفضة الحالة للسكر.
في هذه الدراسة ، أجرينا تحليل التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن هذه السوائل القريبة مناسبة للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل قياس الطيف الكتلي والتنميط الدقيق للحمض النووي الريبي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة لجمع عصارة البنكرياس أثناء الجراحة، وهي مصدر قيم للمؤشرات الحيوية لسرطان البنكرياس. بالإضافة إلى ذلك، تقدم المقالة عينة بديلة، وهي السائل الخلالي للورم، إلى جانب بروتوكولات عزله في النماذج الفأرية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- اكتشاف المؤشرات الحيوية
خلفية علمية
- لا تزال العصارة البنكرياسية غير مستكشفة بشكل كافٍ كمصدر للمؤشرات الحيوية.
- تمتلك هذه العصارة إمكانات للمساعدة في التشخيص قبل الجراحي.
- يعد فهم البيئة المجهرية لسرطان البنكرياس أمراً بالغ الأهمية.
- يمكن أن يؤدي نقل النتائج من الدراسات البشرية إلى النماذج الفأرية إلى تعزيز الأبحاث.
الغرض من الدراسة
- عزل العصارة البنكرياسية والسائل الخلالي للأورام لتحديد المؤشرات الحيوية.
- تقديم بروتوكولات قابلة للتطبيق في كل من النماذج البشرية والفئران.
- تسهيل الدراسات الميكانيكية لسرطان البنكرياس.
الطرق المستخدمة
- جمع عصارة البنكرياس أثناء العملية الجراحية.
- عزل السائل الخلالي للورم.
- تقنيات التصوير لتحديد موقع القناة البنكرياسية.
- جس البنكرياس لتحديده بدقة.
النتائج الرئيسية
- بروتوكولات مُثبتة لعزل السوائل.
- تسليط الضوء على إمكانية استخدام العصارة البنكرياسية كمصدر للمؤشرات الحيوية.
- إثبات جدوى نقل النتائج السريرية إلى النماذج الفأرية.
- توفير أساس للدراسات الميكانيكية المستقبلية.
الاستنتاجات
- يعد عصير البنكرياس والسائل الخلالي للأورام واعدين في أبحاث المؤشرات الحيوية.
- يمكن لهذه البروتوكولات أن تعزز فهم سرطان البنكرياس.
- هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاستكشاف الإمكانات الكاملة لهذه السوائل.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يسمح عزل السوائل القريبة بالاستقصاء المباشر للبيئة المجهرية لسرطان البنكرياس الغدي، مما يمهد الطريق لاكتشاف المؤشرات الحيوية التي تربط بين الملاحظات السريرية والدراسات الميكانيكية قبل السريرية. ومن خلال توفير طرق ميسرة تقنياً لجمع عصارة البنكرياس والسائل الخلالي للأورام في كل من الأنظمة البشرية والفئرانية، يدعم هذا البروتوكول جهود التحقق من الأهداف وتطوير المقايسات التي تركز على التغيرات في البيئة المجهرية. ويعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال توفير سوائل ذات صلة بالمرض تعكس التفاعلات بين الخلايا السدوية والخلايا الورمية، مما يوجه قرارات المضي قدماً أو التوقف في برامج اكتشاف أدوية سرطان البنكرياس.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للصناعات الدوائية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استجواب الفرضيات العلاجية من خلال عزل السوائل التي تتركز فيها المؤشرات الحيوية للبيئة الدقيقة للأورام.
- القيمة التشغيلية: يوفر نظامًا ذا صلة بالمرض للتحقق الوظيفي من الأهداف باستخدام المؤشرات الحيوية للسوائل المجاورة.
- القيمة العلمية: يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال التحليل المقارن للأنماط الظاهرية للأورام المحللة للجلوكوز عبر تقدير كمية glucose و lactate في TIF.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز سوائل بيولوجية مُصادق عليها للتطبيقات اللاحقة مثل مطيافية الكتلة وتوصيف الـ microRNA.
- القيمة التشغيلية: تقديم بروتوكولات عزل موحدة وقابلة للتكرار (الطرد المركزي والاستخلاص) مناسبة لتوسيع نطاق المقايسات.
- القيمة العلمية: استخلاص قراءات كمية للمستقلبات تتيح اكتشاف المؤشرات الحيوية الجاهزة للفحص بقوة تمييزية (دقة 82.4% في OPLS-DA).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: تؤسس لاستمرارية النظام ذي الصلة بالمرض من خلال نقل نتائج عصارة البنكرياس البشرية إلى نماذج السائل الخلالي الورمي (TIF) في الفئران.
- القيمة التشغيلية: تسهل التحقق من الصحة قبل السريرية من خلال عزل السائل الخلالي الورمي (TIF) من نماذج الأورام تحت الجلد التي تعكس التغيرات في البيئة الدقيقة.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال ربط ملفات المؤشرات الحيوية السائلة بالنمط الظاهري للورم.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح توصيف البيئة الدقيقة الذي يوجه الدراسات الميكانيكية وحملات الفحص الموجهة بالمؤشرات الحيوية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال عزل السوائل التي تعكس التفاعلات بين السداة والورم في سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC).
- الفحص: تتيح جاهزية المقايسات من خلال عزل السائل الخلالي للورم (TIF) وعصير البنكرياس بطريقة معيارية، مما يعطي مخرجات كمية من المستقلبات والأحماض النووية.
- التحليلات: توفر مؤشرات حيوية قابلة للقياس (الجلوكوز، واللاكتات، والمستقلبات) لتحليل الحالات المقارنة والفحص المظهري.
- الأبحاث الانتقالية: تربط مرحلة الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال إثبات أن السائل الخلالي للورم (TIF) يعكس حالة تحلل السكر في الورم في النماذج الفأرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لقدرة قابلة لإعادة الاستخدام لعزل السوائل القريبة عبر الأنظمة البشرية والفأرية، مما يقلل من عوائق انتقال النماذج.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: ثقة تنبؤية من خلال الكشف عن المؤشرات الحيوية في البيئة المجهرية والتحقق من الهدف في سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC).
- القيمة التشغيلية: التقييس وقابلية التكرار عبر تقنيات الطرد المركزي والاستخلاص البسيطة لعزل كسور السائل الخلالي للأورام (TIF).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال ربط المؤشرات الحيوية السائلة بالنمط الظاهري للورم، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- تأثير المحفظة: تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر بناءً على ملفات السوائل المميزة للمؤشرات الحيوية (دقة بنسبة 82.4% في حالات PDAC مقابل الحالات غير المصابة بـ PDAC).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع السوائل الجراحية وتشريح الأورام لعزل السوائل القريبة.
- يتطلب معدات طرد مركزي (400 G، 4°C) وتعاملًا معقماً مع السوائل لمعالجة عصارة البنكرياس وTIF.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق الجراحية وفرق علم الأمراض والفرق التحليلية لضمان سلامة العينات.
- يتضمن اعتبارات التكييف لعزل TIF من الفئران عبر الطرد المركزي أو الاستخلاص بناءً على حجم النسيج والتطبيق اللاحق.
- يتضمن قيوداً عملية مثل التحدي التقني في جمع عصارة البنكرياس من الفئران، مما يستدعي استخدام TIF كبديل.
