طريقة فعالة لإنتاج فيروس أدينو
يونيو 10, 2021
هنا، نقدم بروتوكول لإنتاج الفيروس الغدي باستخدام نظام pAdEasy. وتشمل هذه التكنولوجيا إعادة دمج pAdTrack وpAdEasy-1 plasmids، والتعبئة والتغليف الفيروس الغدي والتضخيم، وتنقية الجسيمات أدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة، والحلمة الفيروسية، والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي.
مرحبا بكم في معهد البيولوجيا الخلوية وعلم الأمراض، نيكولاي سيميونيسكو من بوخارست، رومانيا. هنا في مختبر النقل الفيروسي، نعرض جزءا من إنتاج الجسيمات الغدية باستخدام منهجية محسنة تستند إلى نظام AdEasy الذي طوره البروفيسور فوغلشتاين. الخطوات الرئيسية للتكنولوجيا لإنتاج هذه الفيروسات الغدية هي، واحد، إعادة دمج pAdTrack التي تحتوي على GFP مع pAdEasy-1 البلازميد في البكتيريا BJ5183.
اثنين، التعبئة والتغليف الجسيمات أدينوفيرالية. ثالثا، تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293. أربعة، تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.
خمسة، المعايرة الفيروسية والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي. وهنا، سنقدم خطوة هامة في المنهجية. تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.
يبدأ تنقية الفيروس الغدي بحصاد الخلايا المنتجة للفيروس والمتوسط. تم تحويل خلايا AD293 مع البلازميد المؤتلف وكما تم حزم الفيروس الغدي. ثم تم تضخيم الفيروس الغدي من قبل الثقافات الكبيرة المتعاقبة.
هنا، حصلنا على 25 لوحة T175، وبدأنا تنقية الفيروس الغدي من lysate الخلية ووسط الثقافة. أولا، تحققنا من الفلورسينس الأخضر ل GFP الذي تعبر عنه الخلايا المنقولة. إذا كانت الخلايا لا تزال متصلة، وسوف فصل لهم عن طريق النقر على طبق الثقافة أو باستخدام مكشطة طويلة.
يتم جمع الخلايا والمتوسطة. يتم غسل قوارير مع برنامج تلفزيوني، والتي يتم جمعها أيضا في أنابيب فالكون. يتم كريات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
الحفاظ على بيليه الخلية وكذلك وسيلة لمزيد من تنقية الفيروس الغدي. وفي هذه الخطوة، تحظى مساعدة زميل بتقدير كبير لتسريع عملية الحصاد. بيليه الخلية خضراء بسبب التعبير GFP.
يتم إعادة إنفاق بيليه في العازلة تريس hypertonic، والتي من شأنها تسهيل تعطيل الخلايا. بالنسبة لتحلل الخلايا، نستخدم النيتروجين السائل والغاز الجاف الذي يصل درجة حرارته إلى 37 درجة. لا تؤدي أكثر من ثلاث دورات لأن الفيروس سوف يتلف.
لزيادة كفاءة تعطيل الخلية تمر بعناية الخلية تجانس من خلال إبرة حقنة قياس 23. الطرد المركزي الخلية lysate في 9، 600 × ز لمدة 12 دقيقة. تمرير supernatant في أنابيب جديدة والتخلص من الكريات.
الحفاظ على supernatant على الجليد لمزيد من المعالجة عن طريق أجهزة الطرد المركزي للغاية. الآن، نعالج وسيط الثقافة لعزل الفيروس الغدي المنبعث من الخلايا. لهذا، أولا، نحن الوزن الكمية اللازمة من كبريتات الأمونيوم وإضافته إلى الزجاجة التي تم جمعها في المتوسط الثقافة.
الزجاجة تهتز بقوة حتى يتم إذابة البلورات تماما. يتم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ونصف. ثم ينقسم تعليق الراسب إلى أنابيب فالكون.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 1, 600 x g. بعد الطرد المركزي ، يتم التخلص من الناموستة العملاقة ويتم إعادة إنفاق بيليه في 10 ملليمولار تريس العازلة. إذا كان لا يمكن للمرء أن يستمر في تنقية الفيروس الغدي مع خطوة الطرد المركزي الفائق ، يمكن الاحتفاظ المرسب لبضعة أيام في أربع درجات ، ولكن فقط بعد غسيل الكلى لإزالة كبريتات الأمونيوم.
هنا، قدمنا خطوة غسيل الكلى. نحن نستخدم حقنة لإدخال التعليق في كاسيت مبلل سابقا. يتم الاتصال بالعينات مقابل 10 ملليمولار تريس العازلة بين عشية وضحاها في أربع درجات.
وتمثل الخطوة الأخيرة من تنقية خطوة الطرد الفائق على التدرج كلوريد السيزيوم متقطعة. لتشكيل التدرج، أولا، نحن ماصة ثلاثة ملليلتر من محلول الكثافة العالية من كلوريد السيزيوم. فوق هذه الطبقة، صب بلطف ثلاثة ملليلتر من كلوريد السيزيوم منخفض الكثافة.
تعليق الجسيمات أدينوفيرالي من lysate الخلية أو الوسط الثقافة ثم يتم تراكب على رأس التدرج. تمتلئ الأنابيب بالزيت المعدني ويتم إدخالها في دلاء SW41. بعد التوازن ، يتم تحميل الأنابيب بشكل متناظر في الدوار ، والذي يتم إدخاله في جهاز الطرد المركزي الفائق.
يعمل جهاز الطرد المركزي على 35,000 دورة في الدقيقة وأربع درجات لمدة 18 ساعة دون انقطاع. بعد الطرد الفائق ، يتم وضع الأنابيب على حامل مع ورقة سوداء خلفها من أجل حصاد العصابات. يتم التخلص من المرحلة العليا واضحة وحطام الخلية في حاوية النفايات مع محلول التبييض.
يتم حصاد أدنى نطاق يحتوي على الفيروس الغدي الكامل مع طرف ماصة ويتم جمعها في أنبوب Eppendorf معقم. بعد غسيل الكلى، يضاف السكروز إلى التعليق الفيروسي إلى تركيز نهائي بنسبة 4٪، ويتم الاحتفاظ بالعليكوت الفيروسي مجمدا عند ناقص 80 درجة. في قسم النتائج، أظهرنا تعبير GFP في الخلايا التي تم نقلها مع الفيروس الغدي الحصول على.
بعد 48 ساعة من التحويل ، يتم التعبير عن GFP بواسطة الخلايا المنقولة كما هو موضح في المجهر الفلوري. يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا التعبير عن GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. حوالي 50٪ من الخلايا البطانية البشرية والأبقار المنقولة مع 25 وحدة نقل لكل خلية إيجابية GFP.
تم الحصول على نفس العائد من الترواية لخلايا الكبد المورين عندما تم استخدام خمس وحدات تحويل فقط لكل خلية ، ولكن هذا يرتبط بارتفاع معدل الوفيات بسبب حساسية الخلية. تم الحصول على تخفيض إلى التعبير GFP عن طريق نقل الخلايا النجمية mesenchymal بسبب التعبير المنخفض عن مستقبلات محددة. ملاحظات ختامية.
نحن تحسين هذه التكنولوجيا الشاقة للحد من الوقت والتكاليف والجهد اللازم للحصول على الجسيمات أدينوفيرالية. الفيروس الغدي المعد قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا وحفز التعبير عن جين الاهتمام.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مفصلاً لإنتاج الجزيئات الغدية باستخدام نظام pAdEasy. يتضمن العملية خطوات رئيسية مثل إعادة التركيب، التغليف، التضخيم، التنقية، والاختبار الوظيفي للفيروسات الغدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الفيروسات
- العلاج الجيني
- بيولوجيا الخلايا
الخلفية
- تستخدم الفيروسات الغدية على نطاق واسع في العلاج الجيني نظرًا لقدرتها على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا.
- نظام pAdEasy هو طريقة محسنة لإنتاج الفيروسات الغدية.
- فهم عملية التنقية أمر بالغ الأهمية للحصول على جزيئات فيروسية عالية الجودة.
- تساعد العلامات الفلورية مثل GFP في تتبع كفاءة التحول.
غرض الدراسة
- لتحسين بروتوكول إنتاج الفيروسات الغدية لتعزيز الكفاءة.
- لتوفير دليل شامل للباحثين في التحول الفيروسي.
- لإظهار فعالية الفيروسات الغدية المنتجة في التعبير الجيني.
الطرق المستخدمة
- إعادة التركيب للبلازميدات في الخلايا البكتيرية.
- تغليف وتضخيم الجزيئات الفيروسية الغدية في خلايا AD293.
- تنقية الجزيئات الفيروسية الغدية من مستحلب الخلايا والوسط الثقافي.
- الاختبار الوظيفي من خلال تعبير GFP وقياس التدفق الخلوي.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق تنقية ناجحة للجزيئات الفيروسية الغدية.
- حوالي 50% من الخلايا البطانية البشرية والبقرية المتحولة أعربت عن GFP.
- تباينت عوائد التحول بين أنواع الخلايا المختلفة.
- أدت التحسينات إلى تقليل الوقت والجهد في إنتاج الفيروسات الغدية.
الاستنتاجات
- البروتوكول المحسن فعال في إنتاج الجزيئات الفيروسية الغدية.
- يسمح بتوصيل الجينات بكفاءة في أنواع مختلفة من الخلايا.
- يمكن أن تكون هذه المنهجية مصدرًا قيمًا للباحثين في العلاج الجيني.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
