Name: إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: تعلم عزل الخلايا الجذعية الدهنية من نسيج الفأر البربخي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورية. تضمن هذه الطريقة عزلاً عالي النقاء والحيوية لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي للخلية الواحدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نحن نقر بمرفق تحليل الخلايا المجهرية من Mayo Clinic (مايو كلينك) لتحليل التدفق الخلوي الأساسي للحصول على المساعدة في فرز FACS.

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية للحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في Mayo Clinic (مايو كلينك).
1. إعداد الحل 
<ol><li>إعداد الكولاجين 2٪ (ث / الخامس) حل عن طريق حل الكولاجين الثاني 2 ز في 100 مل هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS). Aliquot 200 ميكرولتر لكل استخدام.</li>
	<li>إعداد وسيط تحييد عن طريق خلط 84 مل F-12 المتوسطة، 15 مل مصل الخيل، و 1 مل البنسلين / ستربتوميسين.</li>
	<li>إعداد تدفق العازلة التميتري عن طريق حل 500 ملغ من الألبومين مصل الأبقار (BSA) و 400 ميكرولتر من 0.5 M EDTA في 100 مل من محلول ملحي Dulbecco الفوسفات المخزنة (DPBS).</li>
</ol>2. تشريح من وسادة الدهون epididymal وتفكك الأنسجة
<ol><li>القتل الرحيم إنسانيا (isoflurane / خلع عنق الرحم) فأر ذكر واحد. في هذا البروتوكول، تم استخدام ماوس FVB عمرها أربعة أشهر.</li>
	<li>تطبيق / رش 70٪ الإيثانول على البطن وفضح تجويف البطن السفلي باستخدام مقص نظيفة والملقط.</li>
	<li>تحديد موقع لوحة الدهون الظهارية (قريب / تعلق على الخصيات). عقد تقاطع بين الخصيات ومنصة الدهون epididymal مع ملقط حادة وسحب بلطف لتحرير وسادة الدهون epididymal.</li>
	<li>إزالة الخصيات عن طريق قطع باستخدام مقص واحتضان وسادة الدهون epididymal في 5 مل من HBSS تكملها 3٪ BSA في أنبوب مخروطي 50 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 150 × ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>اتخاذ عائمة رقة الدهون الظهارية من أنبوب مخروطي 50 مل و mince ناعما الأنسجة باستخدام مقص نظيفة.</li>
	<li>أضف محلول 200 ميكرولتر كولاجيناز 2٪ إلى 3.8 مل من HBSS في أنبوب ثقافة 13 مل. إضافة الأنسجة المفروم واحتضان في حاضنة الدورية في 5 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. بدلا من حاضنة الدورية، حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية يمكن استخدامها بدلا من ذلك مع الانفعالات في بعض الأحيان.</li>
	<li>نقل محتويات كاملة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة 10 مل من وسيط تحييد. تخلط بلطف عن طريق عكس الأنبوب 2-3 مرات.</li>
	<li>إعداد أنبوب مخروطي آخر 50 مل مزودة مصفاة خلية 70 ميكرومتر. تصفية الأنسجة المهضوبة في أنبوب جديد باستخدام مصفاة الخلية.</li>
	<li>نقل تدفق من خلال أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>إزالة بعناية الكريات الخلية فائقة وsuspend مع 5 مل من DPBS. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إزالة بعناية فائقة وإضافة 50 ميكرولتر من تدفق العازلة cytometry. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف والحفاظ على الخلايا على الجليد. نظرا لحجم الكريات الخلية وكمية صغيرة من فائقة المتبقية، فإن الحجم الكلي للخلايا في المخزن المؤقت للخلايا تدفق يكون أكبر من 50 ميكرولتر (حوالي 100 ميكرولتر).</li>
</ol>3. وضع علامات الأجسام المضادة وفرز الخلايا المفلورة المنشطة (FACS)
<ol><li>بعد خلط الخلايا جيدا مع الأنابيب لطيف، نقل 54 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب microcentrifuge 1.7 مل. إضافة 6 ميكرولتر من FcR حظر الكاشف ويخلط جيدا عن طريق الأنابيب بلطف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. حفظ أي بقايا الخلايا بعد أخذ 54 μL والاحتفاظ بها في الجليد لاستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة 3.5 والخطوة 3.6.</li>
	<li>أثناء الحضانة في الخطوة 3.1، وإعداد كوكتيل الأجسام المضادة من خلال الجمع بين 11 ميكرولتر كل من المضادة-Sca1-APC، المضادة ل-Ter119-FITC، المضادة لـ CD31-FITC، ومضادات CD45-FITC الأجسام المضادة في أنبوب microcentrifuge. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف والحفاظ على الجليد المحمية من الضوء.</li>
	<li>بعد الحضانة مع FcR منع الكاشف لمدة 10 دقيقة، إضافة 40 μL من كوكتيل الأجسام المضادة وخلط جيدا عن طريق الأنابيب لطيف. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>إضافة 500 μL من تدفق العازلة قياس الخلايا تكملة مع 1 ميكروغرام / مل من DAPI في الخلايا الملطخة. مزيج جيد عن طريق الأنابيب لطيف وخلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. إبقاء الخلايا على الجليد.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من مخزن قياس الخلايا المتدفق إلى الخلايا المتبقية في الخطوة 3.1 واخلط جيداً عن طريق الأنابيب اللطيفة. خلايا التصفية باستخدام أنبوب اختبار 5 مل مع غطاء المفاجئة مصفاة الخلية. الاحتفاظ بهذه الخلايا على الجليد واستخدامها كتحكم غير ملوث في الخطوة التالية.</li>
	<li>خذ الخلايا الملطخة والسيطرة غير الملطخة إلى تحليل FACS أو أداة الفرز.<ol>
<li>تحديد وعزل APC+/FITC-/DAPI- السكان مع استراتيجيات الغاتة الموضحة في الشكل 1. وتمثل هذه الخلايا Sca1 قابلة للحياة+/ Ter119-/CD31-/ CD45- الخلايا. تستنفد مجاميع الحطام والخلية باستخدام مخططات التشتت الأمامي والجانبي .(SSC). ثم، DAPI- يتم بوابات السكان، تليها الغاءات من APC+/ FITC- السكان. يجب استخدام عناصر التحكم غير المُطَرَّكة للمساعدة في تعيين معلمات البوابات.</li>
		<li>جمع الخلايا في 500 ميكرولتر من تدفق العازلة للخلايا في أنبوب microcentuge 1.5 مل. للمضي قدما، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة للحد من التلوث. يتم جمع ما يقرب من 50،000 - 100،000 خلية من فأرة واحدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت لتقييم جدوى الخلية. وبما أن مجاميع الخلايا يمكن أن تتداخل مع تحليلات المصب، فإن وجود مجاميع الخلايا يتم تقييمه أيضاً لضمان وجود الحد الأدنى (<5٪ من عدد الخلايا القابلة للتطبيق) لهذه المجاميع.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

تسلسل RNA خلية واحدة (scRNA-seq) تكتسب بسرعة الجر كأداة قوية لدراسة في وقت واحد مجموعات الخلايا المتنوعة على مستوى الخلية الواحدة. نظراً لارتفاع التكاليف المرتبطة بإعداد العينة وتسلسل الإنتاجية العالية، لا بد من تحسين المدخلات الخلوية (قابلية البقاء العالية والنقاء) لزيادة احتمال النجاح التجريبي. تعتمد بعض بروتوكولات إعداد الخلايا على إزالة الخلايا الميتة والحطام باستخدام يغسل منخفض الدوران وفصل قائم على العمود دون فرز FACS14. العديد من هذه الأساليب، ومع ذلك، يقلل بشكل كبير من عدد الخلايا المستردة...

يلعب النسيج الدهني دورًا رئيسيًا في استقلاب الطاقة. يتم تخزين الطاقة الزائدة في شكل الدهون، والأنسجة الدهنية قادرة على التوسع أو التراجع كبيرة اعتمادا على الوضع الغذائي والطلب النشط. يمكن أن ينتج توسع الأنسجة الدهنية عن زيادة حجم الخلايا الشحمية (تضخم) و/أو من زيادة في عدد الخلايا الدهنية (فرط التنسج)؛ العملية الأخيرة ينظمها بإحكام انتشار وتمايز الخلايا السلف الدهنية1,2. خلال السمنة، الأنسجة الدهنية يتوسع بشكل مفرط، والخلل الوظيفي الأنسجة – بما في ذلك نقص الأكسجة, التهاب, ومقاومة الأنسولين – غالبا ما يتطور3,4. هذه المضاعفات هي عوامل الخطر للعديد من الأمراض المزمنة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والسرطان5. وبالتالي، الحد من توسع الأنسجة الدهنية غير المنضبط وتخفيف أمراض الأنسجة الدهنية هي أعلى أولويات البحوث الطبية الحيوية. خلال توسع الأنسجة الدهنية ، يتكاثر الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية المقيمة (ASCs) ويميز بشكل متسلسل إلى preadipocytes (الخلايا السلف الملتزمة) ثم إلى الخلايا الدهنية الناضجة6. تظهر الدراسات الحديثة أحادية الخلية RNA تسلسل (scRNA-seq) أن هذه الخلايا السلف الدهنية (APC) السكان (ASCs وpreadipocytes) تظهر التجانس الجزيئي والوظيفية كبيرة7,8,9,10,11,12. على سبيل المثال، تعرض ASCs قدرة تمايز adipogenic مخفضة، في حين تظهر أيضًا قدرات أعلى للانتشار والتوسع، مقارنة بـ preadipocytes7. يتم الإبلاغ عن مزيد من الاختلافات الجزيئية داخل ASC والسكان preadipocyte، على الرغم من أن الأهمية الوظيفية لهذه الاختلافات لا تزال غير واضحة7. وتبرز هذه البيانات مجتمعة تعقيد تجمع الخلايا السلف الدهنية وتؤكد على الحاجة إلى تطوير وتوحيد الأدوات لتحسين فهم ومعالجة هذه التجمعات السكانية الحرجة من الخلايا.
هذا البروتوكول تفاصيل عزل Sca1 قابلية عاليةللحياة + مجموعات الخلايا السلف الدهنية من الماوس منصات الدهون الظهارية التي هي مناسبة لتحليلات المتلقين للحساسية، بما في ذلك دراسات الخلية المفردة (scRNA التسلسل) وثقافة الخلية. تم إجراء عزل وتفكك منصات الدهون الظهارية كما سبق وصفها7,13 مع تعديلات طفيفة تحسن من صلاحية الـ APCs المعزولة. باختصار، تلطخ الخلايا المنفصلة من منصات الدهون الظهارية بالأجسام المضادة ضد Sca1، وهي علامة لكل من ASCs وpreadipocytes6و7وعلامات النسب الأخرى (Lin): Ter119 (الخلايا الإريثرويدية)، CD31 (الخلايا البطانية)، وD45 (الكريات البيض). سكا 1 قابلة للحياة+/ Ter119-/ CD31-/ CD45-/ DAPI- ثم يتم فرز الخلايا من قبل فرز الخلايا المنشطة الفلورة (FACS). الأهم من ذلك، تم التحقق من صحة هذا البروتوكول من خلال عزل ناجحة وتحليل Sca1+/Lin- الخلايا السلف الدهنية ذكرت في دراسة حديثة تسلسل RNA خلية واحدة التي حددت الاكتظاظ الفرعي غير متجانسة وظيفيا داخل ASCs و preadipocytes7.

<table><tbody><tr><td>أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 مل أنبوب ثقافة</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 مل أنبوب مخروطي</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 مل أنبوب اختبار مع غطاء مصفاة خلية</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنبوب مخروطي</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 وميكرو ؛ مصفاة الخلايا m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة ل CD31-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد ل CD45-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>الجسم المضاد ل Sca1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة Anti-Ter119-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>كولاجيناز من النوع الثاني</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr> محلول <tr><td>ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 متوسط</td><td>ثيرمو فيشر Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>كاشف حجب FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>مصل الحصان</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين</td><td>ثيرمو فيشر العلمي</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>محلول يوديد البروبيديوم</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس epididymal الأنسجة الدهنية

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

السمنة والاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري, أمراض القلب, والسرطان, وترتبط جميع مع إعادة عرض الأنسجة الدهنية مثيرة. الخلايا الدهنية الدهنية (APCs) الأنسجة المقيمة تلعب دورا رئيسيا في الأنسجة الدهنية التوازن ويمكن أن تسهم في علم الأمراض الأنسجة. إن الاستخدام المتزايد لتكنولوجيات تحليل الخلايا المفردة - بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وبروتيوميكس أحادي الخلية - يحول مجال الخلايا الجذعية/السلفة من خلال السماح بحل غير مسبوق لتغيرات التعبير الخلوي الفردية في سياق التغيرات السكانية أو على نطاق الأنسجة. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتشريح الماوس الأنسجة الدهنية الظهارية، وعزل الخلايا الدهنية واحدة مشتقة من الأنسجة، وتنفيذ الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لإثراء لSCA1+/ CD31 قابلة للحياة-/ CD45-/ Ter119- APCs. وستتيح هذه البروتوكولات للمحققين إعداد مراكز عالية الجودة من الكارود للأفراد مناسبة للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

تم استخدام فئران FVB الذكور البالغ من العمر أربعة أشهر في هذه التجربة. وبعد استبعاد الحطام والمزدوجة باستخدام مخططات FSC/SSC، تم اًبواؤها ببوابات الخلايا القابلة للحياة (DAPI- السكان)، يليها اختيار APC+/ FITC- السكان (الشكل 1). تم رسم بوابات DAPI و APC و FITC استنادًا إلى التحكم غير المطّط. وتظهر استراتيجيات الغاتينغ في الشكل 1.
بعد 1 ح من الفرز، تم تقييم نوعية العزلة كميا من خلال تحليل تدفق قياس الثغر...

نحن نقدم طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية الصالحة للحياة للغاية من منصات الدهون الظهارية الماوس باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلوريس.

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا السلفية الدهنية عالية الجودة من الأنسجة الدهنية البربخية للفأر لتحليلها النهائي الحساس. تنتج هذه التقنية خلايا سلفية دهنية قابلة للحياة للغاية وقد تم التحقق من صحتها في دراسة حديثة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. بعد القتل الرحيم للفأر الذكر، حدد موقع وسادة الدهون البربخية واسحبها برفق باستخدام ملقط حاد للتداول فيها.استخدم المقص لإزالة الخصيتين واحتضان وسادة الدهون البربخية في خمسة ملليلتر من HBSS مكملة ب 3٪ BSA في أنبوب مخروطي 50 مليلتر لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 150 × جم لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة وسادة الدهون البربخية العائمة من الأنبوب المخروطي وافرمها جيدا بمقص نظيف.أضف 200 مل من محلول الكولاجيناز 2٪ إلى 3.8 مل من HBSS في أنبوب ثقافة سعة 13 ملليلترا. ثم نضيف المنسوج المفروم ونحضنه في حاضنة دوارة بمعدل خمس دورات في الدقيقة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية. انقل المحتويات بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وأضف 10 مل من وسط التحييد.تخلط برفق عن طريق قلب الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات. قم بإعداد أنبوب مخروطي آخر سعة 50 مليلتر مزود بمصفاة خلية 70 ميكرومتر وقم بتصفية الأنسجة المهضومة في الأنبوب الجديد. انقل التدفق إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وأجهزة طرد مركزي بمعدل 350 × جم كل 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية بخمسة ملليلتر من DPBS. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 10 دقائق أخرى. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي.امزج الخلايا عن طريق سحب العينات برفق واحتفظ بها على الجليد. سيكون الحجم الإجمالي للخلايا في المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي حوالي 100 ميكرولتر. بعد خلط الخلايا ، انقل 54 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر.أضف ستة ميكرولترات من كاشف حجب FCR والماصة برفق للخلط. ثم احتضان الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. احتفظ بأي خلايا متبقية على الجليد لاستخدامها كعنصر تحكم غير ملطخ.أثناء الحضانة ، قم بإعداد كوكتيل الأجسام المضادة عن طريق الجمع بين 11 ميكرولترا من الأجسام المضادة ل Sca1-APC ، ومضادة ل Ter119-FITC ، ومضادة ل CD31-FITC ، ومضادة ل CD45-FITC في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ماصة الخليط برفق واحتفظ به على الثلج محميا من الضوء. بعد الحضانة باستخدام كاشف حجب FCR ، أضف 40 ميكرولترا من كوكتيل الأجسام المضادة واخلطه جيدا مع ماصة لطيفة.احتضان الخلايا عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق أخرى. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي مكملا بميكروغرام واحد لكل مليلتر DAPI في خلايا البقع. تخلط جيدا وتصفية الخلايا باستخدام أنبوب اختبار سعة خمسة ملليلتر مع غطاء مفاجئ لمصفاة الخلية.ثم احتفظ بالخلايا على الجليد. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي إلى الخلايا غير الملوثة واخلطها عن طريق سحب العينات برفق. استخدم أنبوب اختبار سعة خمسة ملليلتر مع غطاء مصفاة خلية لتصفية الخلايا وإبقائها على الجليد.انقل الخلايا الملطخة والتحكم غير الملوثة إلى أداة تحليل أو فرز FACS. تحديد وعزل السكان الإيجابيين APC ، والسلبيين من FITC ، والسلبيين DAPI باستخدام استراتيجيات البوابات الموضحة في المخطوطة النصية. استخدم عناصر التحكم غير الملوثة للمساعدة في تحديد معلمات البوابات.بعد استبعاد الحطام والمضاعفات باستخدام مخططات FSC-SSC ، تم بوابات الخلايا القابلة للحياة متبوعا باختيار السكان الإيجابيين APC والسلبيين FITC. تم رسم بوابات DAPI و APC و FITC بناء على التحكم غير الملوث. تظهر النتائج التالية عزل الخلايا السلفية الدهنية من ذكور الفئران FVB البالغة من العمر أربعة أشهر.بعد ساعة واحدة من الفرز ، تم تقييم جودة العزل كميا عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي ، والذي أظهر أن الخلايا حافظت على قابلية عالية للحياة والنقاء. يمكن إجراء التحليل الحساس للمصب بعد هذا البروتوكول مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي وقياس التدفق الخلوي. سيمكن ذلك من توصيف الخلايا السلفية الدهنية.الخلايا السلفية الدهنية هي مجموعات غير متجانسة تتطلب مزيدا من الدراسات أحادية الخلية. تتيح هذه الطريقة عزل الخلايا المناسبة للدراسات أحادية الخلية.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو تقنية لعزل واستزراع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون المشتقة من القمة العصبية (ADSCs) المصنفة بالفلورسنت من الأنسجة الدهنية حول قوس الفئران. بعد العزل ، يتم اكتشاف NCADSCs وفرزها باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، ثم يتم زراعتها لاحقا على طبق ، مما يعزز تكاثر الخلايا.

عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون من الأنسجة الدهنية الفئران حول الأبهر

هنا نحن تقرير طريقة لعزل الخلايا خلية خلية خلية (أبك) من الأنسجة الدهنية حول الأوعية (بفات) باستخدام المغناطيسي تنشيط الخلايا فرز (مكس). هذا الأسلوب يسمح لزيادة عزل أبك لكل غرام من الأنسجة الدهنية بالمقارنة مع مضان تنشيط الخلايا الفرز (فاكس).

التوسع و أديبوجينيسيس تحريض الأسلاف خلية شحمية من الأنسجة الدهنية حول الأوعية معزولة من قبل المغناطيسي تنشيط الخلايا الفرز

التفريق بين adipocytes أبيض وبيج من الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية موروث يحمل إمكانات لتحسين التمثيل الغذائي في السمنة. يصف لنا البروتوكولات CD34 + CD31 + عزل الخلية البطانية من الدهون البشرية والتوسع اللاحق في المختبر ، والتمايز في adipocytes بيج وأبيض. وتناقش عدة تطبيقات المتلقين للمعلومات.

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

يصف هذا البروتوكول النهج التقني لعزل المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية الدهنية والالتهابية الليفية من مستودعات الأنسجة الدهنية البيضاء داخل البطن (WAT) عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو فصل الخرزة المغناطيسية المناعية.

عزل المجموعات الفرعية للخلايا اللحمية الأديبوجينية والليفية الالتهابية من مستودعات الفئران الدهنية داخل البطن

يصف هذا التقرير بروتوكولا للعزل المتزامن للخلايا الأولية قبل الخلايا البنية والبيضاء من الفئران حديثي الولادة. يمكن زراعة الخلايا المعزولة في الثقافة وتحث على التفريق إلى خلايا بيضاء وبنية ناضجة تماما. تمكن هذه الطريقة من التوصيف الوراثي والجزيئي والوظيفي للخلايا الدهنية الأولية في الثقافة.

عزل وتمايز الخلايا التمهيدية الأولية البيضاء والبنية من الفئران حديثي الولادة

يصف هذا البروتوكول عزل خلايا الفأر من الدهون تحت الجلد ، وتمايزها إلى خلايا دهنية ناضجة ، وتحريض مقاومة الأنسولين. يتم تقييم عمل الأنسولين عن طريق الفسفرة / تنشيط أعضاء مسار إشارات الأنسولين عبر اللطخة الغربية. تسمح هذه الطريقة بالتحديد المباشر لمقاومة / حساسية الأنسولين في الخلايا الشحمية الأولية.

الخلايا الشحمية الفأرية المتمايزة في الثقافة الأولية: نموذج لمقاومة الأنسولين

يتم عزل الخلايا preadipocytes من الجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين من الفئران حديثي الولادة ومتمايزة إلى خلايا تتراكم قطرات الدهون ، وتعبر عن العلامات الجزيئية ، وتظهر مورفولوجيا الميتوكوندريا للخلايا الشحمية البنية الناضجة. يتم تحليل هذه الخلايا بشكل أكبر عن طريق المجهر المناعي والمجهر الإلكتروني النافذ.

تمايز وتصوير الخلايا الشحمية البنية من الجزء الوعائي اللحمي للأنسجة الدهنية بين الكتفين من الفئران حديثي الولادة

الأنسجة الدهنية هي مصدر ممتاز للخلايا الجذعية الوسيطة. هنا ، نقدم عملية استخراج وزراعة وتوصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) خطوة بخطوة من الأنسجة الدهنية للبربخ في الفئران السويسرية.

العزلة ، التوسع في المختبر ، وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية في البربخ الفأر

أدى حجم وهشاشة الخلايا الشحمية الناضجة إلى الحد من التقنيات والأدوات المتاحة لدراستها وعزلها. هنا ، يتم وصف بروتوكول لعزل الخلايا الشحمية الناضجة من الفئران ، والتي يمكن تكييفها بسهولة مع مستودعات الدهون المختلفة ووجبات الفئران.

عزل واستزراع الخلايا الشحمية الأولية في الفئران من الفئران الخالية من الدهون والسمنة

توليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (اللجنة التوجيهية) تنتج خطوط خطوط مختلفة المحتملة التنموية حتى عندما تمر الاختبارات القياسية لتعدد القدرات. نحن هنا وصف بروتوكول لإنتاج الفئران المستمدة كليا من iPSCs، الذي يحدد الخطوط التوجيهية وتعدد القدرات الكاملة...

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

تعلم عزل الخلايا الجذعية الدهنية من نسيج الفأر البربخي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورية. تضمن هذه الطريقة عزلاً عالي النقاء والحيوية لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبوزي للخلية الواحدة.

إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية

استكشف المزيد من الفيديوهات