Name: التعفن الجاف تعفن التعفن في الحمص: منهجية مفصلة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: تعلم تقنية الورق الماص وتقنية الأصيص المريض لدراسة تفاعل نبات الحمص مع الفطر Rhizoctonia bataticola. تُستخدم هذه الطرق في فحص التراكيب الوراثية للحمص ودراسة آليات الإصابة بالجفاف والعوامل الممرضة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي المشاريع في مختبر M.S.K. 6- تعترف المنظمة السادسة بـ DBT-JRF (DBT/2015/NIPGR/430). نشكر الطلاب المتدربين، الآنسة ريشيكا، والسيد جاياشندرانيان، والآنسة دورغاديفي على المساعدة التقنية أثناء تصوير الفيديو، والسيد سانديب ديكسيت، والآنسة أنجالي، والدكتور أفانيش راي على تقييم البيانات الأولية وملفات المخطوطات تقييماً نقدياً. ونشكر السيد رحيم هـ طرافدار والسيد سوندر سولانكي على مساعدتهما في المختبر. ونحن نعترف DBT-eLibrary كونسورتيوم (DeLCON) ومكتبة NIPGR لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية ومرفق نمو النبات NIPGR لدعم نمو النبات / الفضاء.

1. عزل R. bataticola وتخزين
<ol><li>تفاصيل النمط الجيني للحمص وأعراض DRR<ol>
<li>استخدام النباتات الحمص (نوع وراثي، JG 62) التي تظهر عموما أعراض DRR نموذجية، مثل الجافة، وهشاشة الجذر الأساسي مع عدم وجود جذور جانبية وmicrosclerotia تحت لحاء وداخل11،3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>جمع وغسل<ol>
<li>النباتات اقتلاع تظهر أعراض مثل الجافة القش الملونة ورقة وهشاشة الجذر الأساسي مع microsclerotia تحت طبقة البشرة. في حين اقتلاع، جزء كبير من الجذور سيبقى داخل التربة كما الجذور المصابة هشة. إزالة حطام التربة الخشنة تعلق على الجذر. قطع الجذور بشكل منفصل وجمعها في مغلفات ورقية (27.5 سم × 12 سم) مع التسمية المناسبة ووضعها في صندوق جمع العينات.</li>
		<li>بعد نقل العينات إلى المختبر، ضع الجذور في 200 مل من القارس وتغطية مع شبكة (شبكة نايلون مع حجم المسام من 3 مم قطر)، وغسل الجذور جيدا مع مياه الصنبور الجارية لإزالة جزيئات التربة التمسك.</li>
		<li>استخدام التناضح العكسي (RO) الماء لشطف مرة واحدة في نهاية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>التعقيم السطحي<ol>
<li>كسر الجذور إلى أربع قطع بطول 2 سم مع كل من شفرة مشرط ووضعها في منقار 200 مل نظيفة.</li>
		<li>تجميع الماء RO autoclaved، 2٪ NaOCl، جرة التخلص، والورق النشاف autoclaved (5 سم2)داخل غرفة تدفق لارينار.</li>
		<li>غسل الجذور مع 50 مل من الماء RO autoclaved ثلاث مرات ثم مع 50 مل من 2٪ NaOCl لمدة 10 دقيقة. غسل الجذور مع 50 مل من الماء RO ثلاث مرات مرة أخرى لإزالة NaOCl.</li>
		<li>لطخة تجف الجذور عن طريق وضع الجذور على ورقة النشاف autoclaved وترك حتى يتم تجفيف الجذور.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الإعلام والحضانة<ol>
<li>إزالة حواف الجذور مع شفرة مشرط معقمة. تقسيم الجذور باستخدام شفرة واستخدام ملقط تعقيم لوضعها على البطاطا dextrose أجار (المساعد الشخصي الرقمي) وسائل الإعلام بيتري لوحة تحتوي على كبريتات ستريبتوميسين (50 ملغ L-1)و ampicillin (50 ملغ L-1).</li>
		<li>أغلق الطبق، وختمه بالبارا فيلم، وحضن في حاضنة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة يومين في الظلام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>طريقة طرف الواصلة<ol>
<li>بعد يومين من الحضانة، وجلب لوحات في غرفة تدفق laminar. قطع غيض من نمو الواصلة8 تحت منظار مجسم (Leica EZ4 stereomicroscope التعليمية) ونقلها إلى لوحة المساعد الشخصي الرقمي الطازجة مع كبريتات الستربتومايسين و ampicillin.</li>
		<li>احتضان لوحات في الحاضنة في 28 درجة مئوية لمدة عشرة أيام في الظلام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تخزين وصيانة R. bataticola فطرية inoculum<ol>
<li>جعل الائلات المساعد الشخصي الرقمي في أنابيب الاختبار ونقل المكونات agar الفطرية من لوحة ثقافة عشرة أيام باستخدام حلقة التلقيح تعقيم لهب. ختم غطاء أنبوب الاختبار مع parafilm.</li>
		<li>احتضان الهات على 28 درجة مئوية لمدة عشرة أيام في الظلام.</li>
		<li>ختم الغطاء مع parafilm مرة أخرى وتخزينها في 4 درجة مئوية في الثلاجة للاستخدام في المستقبل.</li>
		<li>ثقافة فرعية كل ستة أشهر للحفاظ على الفطريات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الحفاظ على الفوعة<ol>
<li>تصيب النباتات مع inoculum الفطرية النقية أعدت كما ذكر في تقنية وعاء المريض3. عزل نفس الفطريات من النباتات المصابة (ستسلمات كوخ)9 واستخدامها لإجراء المزيد من التجارب. ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام سلالة معزولة حقل من الفطريات (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. تقنية الورق النشاف
ملاحظة: تقنية الورق النشاف ينطوي على إعداد inoculum الفطرية السائلة، وإعداد الشتلات، وتقييم المرض.
<ol><li>إعداد السائل R. bataticola inoculum ملاحظة: السائل R. باتاتيتشولا الفطرية inoculum يحتوي على كل من الميكريلا وmicrosclerotia. وتعمل هذه الهياكل على حد سواء باعتبارها inoculum الأولية.<ol>
<li>إعداد 500 مل من وسائل الإعلام PDB في قارورة 1000 مل وautoave في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>بعد تبريد وسائل الإعلام ، تلقيح المرق مع القابس من agar الفطرية loopful من ثقافة مائلة فطرية واحتضان في 28 درجة مئوية لمدة خمسة أيام في شاكر في 180 دورة في الدقيقة في الظلام.</li>
		<li>تجميع الزجاج أو قمع البلاستيك autoclaved (10 سم)، قارورة مخروطية لتر واحد، وطبقتين من شبكة (10 سم2 حجم) (شبكة نايلون مع حجم المسام من 3 مم قطر) على الطاولة. تصفية mycelia الفطرية وmicrosclerotia باستخدام شبكة. لطخة تجفيف الفطريات في ورقة النشاف autoclaved.</li>
		<li>تزن 100 غرام mycelia ل50٪ inoculum والحفاظ على درجة حرارة الغرفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد نبات الحمص<ol>
<li>حدد 50 بذور صحية (في هذه الدراسة، تم استخدام النمط الجيني DRR-عرضة JG 62)، ووضعها في 100 مل من الكوابر، وتغطية مع شبكة.</li>
		<li>غسل البذور مع مياه الصنبور أولا لإزالة حطام التربة.</li>
		<li>خذ القارص مع البذور في غرفة تدفق الفلامي وغسلها مع تعقيم 50 مل من الماء RO ثلاث مرات لمدة 1 دقيقة لكل غسل.</li>
		<li>تعقيم البذور مع 50 مل من 2٪ NaOCl مائي لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز مستمر وغسل البذور مع 50 مل من المياه المعقمة خمس مرات لمدة 1 دقيقة لكل من.</li>
		<li>ملء كيس البوليثين (47.5 سم × 25 سم) مع Soilrite (خليط من الصف البستانية الموسع البيرلايت، الطحالب الخث الأيرلندية، والفيرميكوليت المقشر في نسبة متساوية أي، 1/3:1/3:1/3)، بذر البذور 50 معقم سطح 50 سم عمق، والحفاظ في غرفة النمو مع 28 درجة مئوية ± درجة حرارة 2 درجة مئوية، 16 ساعة photoperiod مع كثافة الضوء من 150 ميكرومولمتر −2 -1،والرطوبة النسبية من 70٪. المياه لهم مع المياه RO واقتلاع النباتات بعد ثمانية أيام من بذر.</li>
		<li>غسل الجذور في مياه الصنبور لإزالة جزيئات Soilrite. شطف الجذور مع المياه عقمة RO، والاحتفاظ بها في الماء RO في 1000 مل من القارص.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الورق النشاف في الصواني<ol>
<li>خذ ورقة النشاف وقطعها إلى قطع (30 سم × 23 سم) بأعداد كافية لتلبية النسخ المتماثلة.</li>
		<li>احزم الأوراق في كيس البوليثين القابل للتكلاف التلقائي وأتلافها بـ 121 رطلاً لمدة 15 دقيقة واحفظها في فرن الهواء الساخن للتجفيف.</li>
		<li>أضعاف كل ورقة النشاف في النصف.</li>
		<li>ضع الورق على صينية بلاستيكية نظيفة ، مسحت الروح ، كما هو موضح في الشكل 2i-iv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تلقيح النبات عن طريق غمس<ol>
<li>قم بحل 100 غرام من inoculum الفطرية في 200 مل ماء RO autoclaved في 200 مل من الكأس للحصول على 50٪ inoculum.</li>
		<li>تراجع جذور النبات في inoculum المعدة لمدة 1 دقيقة مع حركة متقطعة صعودا وهبوطا لضمان التعلق موحدة من inoculum الفطرية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>وضع النباتات في ورقة النشاف<ol>
<li>الرطب في الجانب السفلي من ورقة النشاف وضعت على صينية مع الماء RO العقيمة. ضع النباتات على الورق بطريقة لا تغطيها الورقة إلا الجذور، وتُترك البراعم خارجها.</li>
		<li>أغلقها عن طريق طي الجانب العلوي من الورق النشاف والرطب ورقة كاملة لتوفير ما يكفي من المياه للحفاظ على نمو النبات.</li>
		<li>اسقي الصينية مرة واحدة في اليوم وإبقاء الصواني عند 28 درجة مئوية. مراقبة الأعراض مثل نخر، تعفن الجذر، ورقة اصفرار يوميا.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. المريضة وعاء تقنية
ملاحظة: تقنية وعاء المريضة ينطوي على إعداد inoculum خبيثة ووعاء المرضى، والحفاظ على مستوى الرطوبة، وتقييم أعراض المرض.
<ol><li>إعداد الركيزة<ol>
<li>خذ كيلوغرام واحد من أي بذور الحمص المتاحة تجاريا. إزالة البذور المصابة (البذور مع النمو الفطري، وبقع العدوى، والأضرار الحشرية). وضعها في 5 لتر من البلاستيك واغسل بالماء الصنبور بدقة 3-4 مرات لإزالة الحطام الرئيسية.</li>
		<li>غسل البذور مع 2 لتر من الماء RO ثلاث مرات ونقع بذور 1 كجم في 5 لتر من الكوابر مع ثلاثة أضعاف المزيد من المياه لمدة خمسة ساعات.</li>
		<li>مرة واحدة البذور imbibed الماء، وإعادة غسلها بالماء RO ثلاث مرات لإزالة البذور exudates.</li>
		<li>إزالة الماء تماما وحزم البذور في زجاجات مربى (300 مل، 12 سم ارتفاع، 6 سم قطرها 155 غرام الوزن) إلى حوالي 1/4th القدرة (100 غرام لكل زجاجة مربى) وإغلاق الزجاجات مع قبعات. حزمة 10 زجاجات مربى في كيس بلاستيكي قابل للوتوماتيك (48 سم × 30 سم) الأوتلاك مرتين في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة بشكل مستمر.</li>
		<li>جفف البذور على حرارة 40 درجة مئوية في فرن بين عشية وضحاها لإزالة قطرات الماء داخل الزجاجة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد ثقافة المرضى<ol>
<li>قم بتشغيل غرفة تدفق الفارني BSL-2 مستوى. امسح الأرض بدقة مع 70٪ من الإيثانول، واقلب الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. ثم، والحفاظ على البذور داخل غرفة تدفق لارينار.</li>
		<li>خذ ثقافة R. bataticola المعزولة حديثًا لمدة 10 أيام (الجزء 1). ثم، واتخاذ ثلاثة المقابس أجار الفطرية (4 ملم قطر) باستخدام طرف ماصة معقمة أو الفلين بور، ووضعها في زجاجات مربى aseptically. تغطية الزجاجات مع قبعات وختم مع parafilm.</li>
		<li>يهز الزجاجات لخلط القرص الفطري مع بذور الحمص بشكل موحد.</li>
		<li>احتضان الزجاجات في 30 درجة مئوية لمدة 15 يوما في الظلام.</li>
		<li>خذ زجاجات المربى مع نمو الفطريات السوداء(الشكل 4iii)ونقل الثقافة المريضة (البذور مع microsclerotia) من زجاجات المربى إلى لوحة بيتري الزجاج باستخدام ملقط العقيمة. جففها في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين في طبق من الزجاج.</li>
		<li>مسحوق كتلة الفطرية باستخدام هاون وحشرات، وتخزين مسحوق في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>Autoclave Soilrite مرتين في 121 رطلا لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>جفف مزيج Soilrite المُتَرَكَف تحت اِشِدِة شمسية.</li>
		<li>اخلطي مسحوق الفطريات مع Soilrite بنسبة 50٪ ث/ث، واملأ الأواني بالخليط، واحفظيها في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم.</li>
		<li>زرع بذور الحمص القابلة للجفاف القابلة للسطح في وعاء (10 سم جولة الأواني)(جدول المواد)والحفاظ على مستوى الرطوبة من 80٪ قدرة الحقل (FC).</li>
		<li>مراقبة الأعراض مثل نخر وتعفن الجذر عن طريق اقتلاع النباتات بعد الإنبات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تقييم كفاءة وعاء المرضى ملاحظة: تظهر النباتات أعراض صفراء صفراء عندما تكون الجذور فاسدة تمامًا.<ol>
<li>وضع درجة المرض على أساس الآفة (البقع النخرية) (الشكل التكميلي 2C)أرقام وشدة تعفن الجذر. يمكن استخدام الأواني المرضية التي تظهر 90٪ من وفيات النباتات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>فحص النمط الجيني<ol>
<li>إعداد الثقافة المريضة بكميات كبيرة وخلطها إما مع Soilrite معقمة أو التربة الحقل (5٪ ث / ث) في الأواني 30 سم طويل القامة. المياه الأواني لتبلل السطح وتركها دون عائق لمدة سبعة أيام.</li>
		<li>زرع واحدة من البذور السطحية المعقمة لكل وعاء جولة 10 سم وثلاث بذور لكل 30 سم جولة الأواني والمياه لهم بشكل كاف.</li>
		<li>مراقبة صفراء ورقة وجذور أعراض التعفن.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الجفاف المشترك وعدوى R. bataticola<ol>
<li>فرض ضغوط الجفاف باتباع البروتوكولات المذكورة في سنها وآخرون (2019).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
<li>Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135">http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135</a> (2016).</li>
<li>Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+drought+stress+on+simultaneously+occurring+pathogen+infection+in+field-grown+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea.</a> Scientific Reports. 9 (1), (2019).</li>
<li>Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chickpea+diseases%3A+resistance+screening+techniques%2C+information+bulletins+No.+10.+Patancheru%5BTitle%5D)+AND+%22Information+Bulletin+No.+10.+Patancheru%2C+A.P.%2C+India%3A+International+CroDS+Research+Institute+for+the+Semi-Arid+Tropics%22%5BJournal%5D)">Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru.</a> Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).</li>
<li>Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sources+of+multiple+disease+resistance+in+mini-core+collection+of+chickpea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea.</a> Plant Disease. , (2006).</li>
<li>Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+combined+abiotic+and+biotic+stresses+on+plant+growth+and+avenues+for+crop+improvement+by+exploiting+physio-morphological+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li>
<li>Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpho-physiological+traits+and+molecular+intricacies+associated+with+tolerance+to+combined+drought+and+pathogen+stress+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnologies+of+Crop+Improvement%2C+Volume+3%3A+Genomic+Approaches%22%5BJournal%5D)">Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants.</a> Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).</li>
<li>Jensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+methods+for+fungal+brood+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Apicultural+Research%22%5BJournal%5D)">Standard methods for fungal brood disease research.</a> Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).</li>
<li>Agrios, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+G+%22Plant+Pathology%3A+Fifth+Edition%22">Plant Pathology: Fifth Edition</a>. , 9780080473(2004).</li>
<li>Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+germination+of+fungal+sclerotia%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Survival and germination of fungal sclerotia.</a> Annual Review of Phytopathology. , (1971).</li>
<li>Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagamma%2C+G+%22Screening+of+chickpea+genotypes+against+dry+root+rot+caused+by+Macrophomina+phaseolina+%28tassi%29+goid%22">Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid</a>. 10 (4), 1795-1800 (2015).</li>
<li>Infantino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+techniques+and+sources+of+resistance+to+root+diseases+in+cool+season+food+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Euphytica%22%5BJournal%5D)">Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes.</a> Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).</li>
<li>Khaliq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+dry+root+rot+of+chickpea+caused+by+Rhizoctonia+bataticola+under+the+natural+field+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition.</a> Biotechnology Reports. 25, 00423(2020).</li>
</ol>

ليس لدينا ما نكشفه

توفر تقنية الورق النشاف نهجًا مباشرًا لفحص الأنماط الجينية للحمص في ظل ظروف المختبر. التلقيح الانخفاض تمكن من التحقيق في التفاعل على أساس زمني مع سهولة السيطرة على الحمل inoculum(الشكل التكميلي 1)ويسهل فحص في المختبر. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الشتلات حتى الشباب. يمكن أن تعطي ثقافة فطرية عمرها خمسة أيام(الشكل 1B)ما يكفي من التلقيح لتصيب النباتات. يحتوي inoculum السائل على كل من الميكوليا وmicrosclerotia (الشكل 1D & E). يمكن ا...

تعفن الجذر الجاف (DRR) هو واحد من الأمراض ذات الأهمية الاقتصادية في الحمص1،2. وهو مرض الجذر محددة الناجمة عن Rhizoctonia bataticola (teleomorph، Macrophomina phaseolina). النباتات المصابة تفتقر إلى الجذور الجانبي وتمتلك taproots هشة وأوراق الشجر الصفراء1,3. وقد أفيد عن أن DRR تحت ضغط الجفاف يشكل تهديدا ناشئا لزراعة الحمص1،2،3. وعلاوة على ذلك، أفيد أن حالات الحد من مخاطر الكوارث قد تفاقمت في ظل ضغوط الجفاف في ظل الظروف الميدانية1و2و3. DRR هو أكثر انتشارا في المناطق البعلية مما هو عليه في الحقول المروية4. استخدام أصناف مقاومة هو السبيل للتغلب على المرض والتحايل على استخدام مبيدات الفطريات1،13. لأن الجرثومة الحمص المتاحة في جميع أنحاء العالم الموانئ الاختلاف الجيني ل السمة5، والفرز وتحديد المقاومة / الأنماط الجينية المعرضة أمر بالغ الأهمية للتربية الجزيئية لتحسين المحاصيل.
قوية وسهلة وفعالة من حيث التكلفة اختبار المرض ضرورية للتحقيق في أنماط العدوى R. bataticola في الحمص. إن فحص المرض الأساسي المستخدم لمراقبة استجابة الأنماط الجينية للحمص إلى عدوى R. bataticola هو تقنية الورق النشاف1،4. بل هو تقنية بسيطة ويمكن تنفيذها باستخدام inoculum الفطرية السائلة، الشتلات مع الجذور، ورق النشاف العقيمة. ومع ذلك، لم يتم استخدام هذه التقنية إلى أقصى حد لأنه لا يوجد بروتوكول خطوة بخطوة متوفرة في الأدبيات.
وفي الوقت نفسه، ينطوي أسلوب وعاء المريض إعداد ثقافة المرضى المحتملين وفرض الإجهاد الجفاف. وبالنظر إلى أن الإجهاد الجفاف يؤدي إلى تفاقم الإصابة بمرض DRR3، فمن الضروري دراسة التفاعل النباتي - الممرض تحت ضغط الجفاف6،7. توفر تقنية الوعاء المريضة منصة لمثل هذه الدراسة المتزامنة ، وتعزيز إمكانيات أفضل لفحص الجرثومي وفهم الأساس الميكانيكي للتفاعل. يمكن معالجة التغيرات في علم المناخ مثل زيادة في طول الجذر والحد من عدد الجذر الجانبي — المتأصلة في مرض DRR — باستخدام تقنية وعاء المريض1,3,7.
هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل للورق النشاف وتقنيات وعاء المريضة، والتي يمكن استخدامها لدراسة التفاعل بين الحمص وR. bataticola وشاشة الحمص الجرثومية. وترد تفاصيل المواد المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

<table><tbody><tr><td>Fungus- Rhizoctonia bataticola</td> <td>لقاح مسببات الأمراض</td><td>من النوع الهندي مجموعة الثقافة رقم 8365</td><td>GenBank: MH509971.1 ، ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp ؛ id = 1251 & Itemid = 1370)</td></tr> <tr><td>مزيج التربة</td><td>وسط التربة في المختبر</td><td>Keltech Energies Limited ، بنغالور ، الهند</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td>ورق الترشيح</td> ورق <td>النشاف لدعم نمو النبات</td><td>هيميديا</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>وعاء</td><td>زراعة النباتات</td><td>أواني بحجم 10 و 30 سم</td><td>أواني الحضانة المستخدمة بشكل روتيني ، على سبيل المثال ، https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html</td></tr><tr><td>سكر العنب البطاطس أجار / مرق</td><td>ثقافة الفطر والحفاظ على الفطر</td><td>Cat # 213400 ، DifcoTM ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>حاضنة</td><td>زراعة الفطريات</td><td>LOM-150-2 و S / N AI13082601-38 و MRC وحاضنة وشاكر</td><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131</td></tr><tr><td>غرفة النمو</td><td>زراعة النباتات في حالة خاضعة للرقابة</td><td>نموذج رقم A1000 ، كونفيرون ، كندا</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>تدفق الهواء الرقائقي</td><td>تنفيذ تمارين معقمة</td><td>Telstar ، Bio II advance ، خزانة من الفئة الثانية ، EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/ ، شبكة http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td></td><td>تصفية الفطريات</td><td>الفطرية شبكة ناموسية نايلون</td><td> مع حجم المسام بقطر 0.6-1 مم</td></tr><tr><td>الأوتوكلاف</td><td>الأوتوكلافينج وسائل الإعلام وبذور الحمص</td><td>الأوتوكلاف</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>المجاهر</td><td>تصور العدوى انج الفطريات</td><td>الفطرية SMZ25 / SMZ18 ، المجاهر المجسمة البحثية ، المجهر المجسم التعليمي Leica EZ4</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>ميزان</td><td>الوزن وزن الفطريات والمواد الكيميائية</td><td>Sartorius ميزان الوزن الإلكتروني Sartorius ، BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>تلطيخ الفطريات</td><td>Sigma</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr>تلطيخ<td>الفطريات الأزرق الأنيلين</td><td></td><td>هيميديا</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

التعفن الجاف تعفن التعفن في الحمص: منهجية مفصلة

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

يُشكل مرض تعفن الجذر الجاف (DRR) تهديدًا ناشئًا للإجهاد الحيوي لزراعة الحمص في جميع أنحاء العالم. ويتسبب في ذلك من قبل مسببات الأمراض الفطرية التي تحملها التربة، Rhizoctonia bataticola. في الأدبيات ، وشاملة ومفصلة بروتوكولات خطوة بخطوة على مقايسات المرض متناثرة. تقدم هذه المقالة تفاصيل كاملة عن الخطوات التي تتضمنها في إعداد تقنية الورق النشاف لفرز النماذج الجينية بسرعة لمقاومة DRR. تقنية الورق النشاف سهلة وأقل تكلفة. طريقة أخرى، استنادا إلى نهج وعاء المريض، هو تقليد العدوى الطبيعية ويمكن تطبيقها لدراسة المكونات التفاعل - النبات، الممرض، والبيئة- المشاركة في مثلث المرض.
وعلاوة على ذلك، يحدث في الطبيعة معدل الجفاف في معظم الأحيان في مناطق زراعة الحمص البعلي، حيث تنحسر رطوبة التربة مع تقدم نمو المحاصيل. ومن المعروف الإجهاد الجفاف لضمير نباتات الحمص لمرض DRR. يمكن أن يمهد الفهم الباثومورفولوجي والجزيئي للتفاعل بين النبات والأورام تحت ضغط الجفاف الطريق لتحديد أصناف مقاومة للحمض الكاسح من بركة الحمص الجرثومية. توفر هذه المقالة منهجية تدريجية لإعداد وعاء مريض ومقايسة المرض اللاحقة. وعموما، فإن المعلومات المقدمة هنا سوف تساعد الباحثين على إعداد R. bataticola inoculum الفطرية، والحفاظ على هذا الممرض، وإعداد تقنية ورقة النشاف، وإعداد الثقافة المريضة ووعاء المرضى، وتقييم العدوى المسببة للأمراض في نباتات الحمص.

تهدف هذه الدراسة إلى إظهار تقنيات مثل الورق النشاف وتقنيات الوعاء المريض لتسهيل الفهم ال pathomorphological والجزيئية للتفاعل بين النبات ومسببات الأمراض تحت ضغط الجفاف. لتحقيق ذلك، تم جمع النباتات التي تظهر أعراض DRR1،3،4 من حقل الحمص ، وتم عزل الفطريات باستخدام طريقة طرف الواصلة8. R. ثقافة فطرية bataticola يظهر رمادي داكن على لوحة المساعد الشخصي الرقمي ومائل على أربعة أيام بعد الحضانة (<strong c...

تقدم هذه الدراسة منهجيات لدراسة الآليات البكولوجية والجزيئية الكامنة الكامنة في الحمص – تفاعلRhizoctonia bataticola. طريقة ورقة النشاف مفيد لدراسة بسرعة استجابات الحمص النمط الجيني، في حين أن الطريقة المريضة القائمة على وعاء يمكن استخدامها لفرض الجفاف في وقت واحد وعدوى R. bataticola والشاشة للنوعين الجينيين متسامح.

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو إثبات منهجية مفصلة من الوفيات مرض تعفن الجذر الجاف، مثل تقنية الورق النشاف وتقنية وعاء المريض. هذه التقنيات سوف تكون مفيدة لدراسة التفاعل بين نبات الحمص و Rhizoctonia bataticola. فهم تفاعل نبات الحمص مع مسببات الأمراض الفطرية Rhizoctonia bataticola مهم زراعيا.لهذا، هناك حاجة إلى مقايسات متعددة الاستخدامات وقابلة للاستنساخ للغاية. هنا، اثنين من المقايسات التي تستخدم على نطاق واسع في مختبرنا هي أظهرت. واحد منهم هو النشاف ورقة المستندة، والآخر هو المريض وعاء القائمة على المقايسة.لتنفيذ مقايسة الورق النشاف، إعداد ريزوكتونيا bataticola الفطر من خلال التوسع من ثقافة مائلة إلى لوحة بيتري ومن ثم إلى الثقافة السائلة. إعداد حضانة الحمص من قبل، بذر البذور في وعاء كبير. اقتلاعهم ووضعهم في inoculum السائل ووضعها على ورقة النشاف.مراقبة لأعراض المرض، وهي نخر على الجذر، تعفن الجذر، والأوراق اصفرار بعد ثمانية أيام من التطعيم. هو مبين هنا هو باختصار ، والخطوات في تقنية الورق النشاف. لتنفيذ جرعة المريضة وعاء، تلقيح وجبة الحمص مع الفطريات.بعد الاحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 15 يوما، يتم الحصول على الثقافة المريضة. ثم، مسحوق لهم وخلطها مع مزيج وعاء. زرع البذور على وعاء السيطرة ووعاء المرضى.في الأيام التالية، لاحظ الأعراض، وهي النخر على الجذر، تعفن الجذر، وصفراء ورقة على النباتات المصابة، بعد 10 أيام من بذر. يمكن توسيع الوعاء المريض ويمكن استخدامه في الفحوصات واسعة النطاق. يظهر هنا هو باختصار من الخطوات في تقنية وعاء المريض.Rhizoctonia bataticola هو الممرض النامية. هذا الفطر تنتج هيفا وميكروسكلروتيا، والتي تعمل كما inuclum الأولية خلال عدوى النبات. يتم استخدام الثقافة النقية التي تطبق من خلال طريقة العزل للتشكيلات.النقطة الرئيسية لهذه المقايسات الناجحة هي الحمل الأمثل inoculum. مظاهرة من تقنية الورق النشاف يبدأ هنا. لإعداد السائل Rhizoctonia bataticola inoculum، تلقيح مرق 500 مل مع المكونات agar الفطرية من ثلاثة أيام ثقافة لوحة جديدة من العمر واحتضان القارورة في حاضنة في 28 درجة مئوية لمدة خمسة أيام.تصفية المايسيليا الفطرية الرمادية الداكنة مع microsclerotia. التوقف المرحلي في الماء المُقلَد من الوُكّاف وإزالة الوسائط. مرة أخرى، تصفية من mycelia وإزالة الرطوبة عن طريق تجفيف البقعة mycelia لبضع دقائق.تعليق 100 غرام من inoculum الفطرية في 200 مل من الماء autoclaved في زجاجة مربى وخلطه بشكل صحيح. تطوير حضانة الحمص عن طريق زرع البذور المعقمة السطحية في solerant. اقتلاع النباتات بعد ثمانية أيام من البذر ، وغسلها وشطفها بـ ro. خذ ورقة نشاف وأضعاف مرة واحدة ووضع نصفها على الدرج.جعله الرطب مع الماء autoclaved. تأخذ النباتات وتراجع في inoculum لمدة 30 ثانية مع حركة متقطعة صعودا وهبوطا. وضع النباتات في مثل هذه الطريقة التي يتم تغطية الجذور داخل ورقة و folia يبقى خارج.أضعاف النصف الآخر وثني ورقة. للسيطرة، تراجع النباتات في المياه autoclaved، والحفاظ على الصواني في غرفة النمو لمدة ثمانية أيام. نتائج. مراقبة لأعراض مثل ورقة اصفرار، تعفن الجذر، نخر في الجذر، والحد من عدد الجذر الجانبي.مظاهرة من تقنية وعاء المريض يبدأ هنا. خذ كيلوغرام واحد من بذور الحمص التجارية. غسل البذور مع مياه الصنبور ويغسل مرة أخرى مع الماء RO.نقع البذور لمدة خمس ساعات. مرة أخرى، وغسل البذور بالماء RO إضافة 300 غرام في زجاجة مربى. اُتّمَفّها في 121 LVS لمدة 15 دقيقة بشكل مستمر.بعد التبريد، نقل الزجاجة من خلال تدفق لارينار. تلقيح الزجاجات مع ثلاثة agar الفطرية المقابس ما يقرب من أربعة ملليمتر مربع الأحجام وهز عليه جيدا لخلط بشكل صحيح. لف الزجاجات واحتضانها في حاضنة في 30 درجة مئوية لمدة 15 يوما.مراقبة للزجاجات مع نمو داكنة حول بذور الحمص وإزالة البذور. جففها في درجة حرارة الغرفة ومسحوقها. خلط Rhizoctonia bataticola مسحوق مع سولوريت والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمسة أيام.السطح تعقيم بذور GT62 وزرعها على عمق سنتيمترين. نتائج. مراقبة ل 90٪ وفيات في وعاء المرضى. بعد 10 أيام من البذر ، لاحظ لأعراض مثل النخر في الجذور والحد من عدد الجذر الجانبي واصفرار الورقة في الأيام التالية.يمكن إعداد وعاء المريض في التربة الحقل كذلك. الجفاف و Rhizoctonia bataticola العدوى. فرض الإجهاد الجفاف في وعاء المرضى عن طريق حجب المياه.تظهر هنا النباتات التي تخضع للسيطرة والجفاف، والعوامل المسببة للأمراض، والجفاف المتزامن والإجهاد الممرض. مراقبة لأعراض, وهي, المزيد من نخر, تعفن الجذر, والحد من عدد الجذر الجانبي, وطول الجذر في علاج الإجهاد مجتمعة بالمقارنة مع العلاج الممرض فقط. الاستنتاجات. يمكن تنفيذ تقنية الورق النشاف في ظروف في المختبر.يمكن تنفيذ تقنية وعاء المريضة في ظروف في فيفو. في ميناء المرضى، يمكن فرض الإجهاد اللاأحيائي، أي الإجهاد الجفاف، جنبا إلى جنب مع العدوى المسببة للأمراض. باستخدام هذه التقنيات، يمكن للمرء أن دراسة نمط العدوى المسببة للأمراض.تحدث معظم التغيرات الفسيولوجية أثناء تفاعل الحمص-ريزوكتونيا باتاتيتشولا، كما يتم فحص الأنماط الجينية للحمص من أجل المقاومة. إن تحليل الورق النشاف مفيد جدًا لتوليد عينات عالية الجودة للدراسات المجهرية والبيولوجيا الجزيئية. يتم تطبيق فحص الوعاء المريض ، الذي يحاكي حالات العدوى الطبيعية ، لفحص الجرثومة الحمصية.

dry-root-rot-disease-assays-in-chickpea-a-detailed-methodology

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يعد القياس الكمي لنمو مسببات الأمراض أداة قوية لتوصيف الاستجابات المناعية المختلفة لأرابيدوبسيس ثاليانا (المشار إليها فيما يلي: نبات الأرابيدوبسيس). تقدم الطريقة الموضحة هنا مقايسة تسلل حقنة محسنة لتحديد كمية Pseudomonas syringae pv. البقعة نمو ES4326 في أوراق نبات الأعربي البالغة.

بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em&gt; Pathosystem

السليلوز البلوري هو مكون مهم لجدار الخلية النباتية. ومع ذلك ، فإن القياس الكمي بدقة خلوية يمثل تحديا تقنيا.  هنا ، نبلغ عن استخدام تقنية الضوء المستقطب والمقاطع العرضية للجذور للحصول على معلومات عن تكوين جدار الخلية بدقة زمانية مكانية.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

ويدعم النظام كوكولتفاتيون المائية المائية النباتات سليمة مع شاشات شبكة معدنية وتزرع لهم البكتيريا. ويمكن بعد ذلك تحصين الأنسجة النباتية والبكتيريا والجزيئات التي تفرز بشكل منفصل لتحليل المصب، مما يسمح في وقت واحد للاستجابات الجزيئية من كل من المضيفين النبات والتفاعل الميكروبات أو الميكروبيوم ليتم التحقيق فيها.

نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير

قدم هو بروتوكول مقايسة منافسة لوحة تحديد ما إذا كان سماد محددة من المحتمل أن تحتوي على البكتيريا والفطريات التي تقمع نمو سولاني مرضى.

لوح منافسة مقايسة كتقييم أولى سريع لقمع المرض

تتطلب إدارة ذبول الفيوزاريوم للبطيخ معرفة الأجناس المسببة للأمراض الموجودة. هنا ، نصف تراجع الجذر ، وبذر النواة الموبوءة ، وطرق التلقيح المعدلة بالدرج لإثبات فعاليتها في كتابة العرق للفطريات المسببة للأمراض Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

تباين بين ثلاث تقنيات تلقيح تستخدم لتحديد جنس الفيوزاريوم أوكسيسبوروم f.sp غير المعروف. نيفيوم يعزل

يقدم هذا البروتوكول ملخصا مفصلا لاستراتيجيات تلقيح جذور النباتات بالميكروبات التي تنقلها التربة. مثال على الفطريات Verticillium longisporum و Verticillium dahliae ، يتم وصف ثلاثة أنظمة عدوى جذرية مختلفة. يتم تسليط الضوء على التطبيقات المحتملة والتحليلات النهائية المحتملة ، وتناقش المزايا أو العيوب لكل نظام.

استراتيجيات التلقيح لإصابة جذور النباتات بالكائنات الحية الدقيقة التي تنقلها التربة

نحن نستخدم أدوات معملية بسيطة لفحص بنية نظام الجذر (RSA) ل Arabidopsis و Medicago. تزرع النباتات في الماء فوق شبكة وتنتشر باستخدام فرشاة فنية للكشف عن RSA. يتم التقاط الصور باستخدام المسح الضوئي أو كاميرا عالية الدقة ، ثم يتم تحليلها باستخدام ImageJ لتعيين السمات.

بروتوكول بسيط لرسم خرائط سمات بنية نظام جذر النبات

تصف هذه الورقة طريقتين للتنميط الظاهري دون استخدام تقشير البشرة لتوصيف الجينات التي تتحكم في نمو الثغور. توضح الطريقة الأولى كيفية تحليل النمط الظاهري للثغور باستخدام بشرة نباتية زرقاء اللون بالتولويدين على شكل حرف O. تصف الطريقة الثانية كيفية التعرف على روابط الثغور ومراقبة أنشطتها البيولوجية.

تحديد الجينات المشاركة في تطور الثغور عن طريق تسجيل النمط الظاهري للبشرة

هنا ، نصف أداة متقدمة مصممة لمراقبة التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة الشتلات من أرابيدوبسيس . توفر المنهجية الجديدة تصويرا غير جراحي مضان الكلوروفيل في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية.

الفحص غير الجراحي لتحديد حركية التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة التخليق من أرابيدوبسيس

وقد أثبتت عكس النهج الوراثية مفيدة للغاية لتحديد الجينات التي تشكل أساس المقاومة لمسببات الأمراض في ناقلات البعوض. هذا البروتوكول الفيديو يوضح الطريقة التي يستخدمها المختبر Dimopoulos لحقن الرنا المزدوج الجديلة في الأنوفيلة غامبياي ، التي ترعى طفيل الملاريا. ويتجلى أسلوب التلاعب الإعداد الحقن وحقن الرنا المزدوج الجديلة في القفص الصدري.

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

تعلم تقنية الورق الماص وتقنية الأصيص المريض لدراسة تفاعل نبات الحمص مع الفطر Rhizoctonia bataticola. تُستخدم هذه الطرق في فحص التراكيب الوراثية للحمص ودراسة آليات الإصابة بالجفاف والعوامل الممرضة.

التعفن الجاف تعفن التعفن في الحمص: منهجية مفصلة

استكشف المزيد من الفيديوهات