حاد الدماغ الماوس تشريح للتحقيق عفوية نشاط شبكة فرس النهر

يصف هذا البروتوكول إعداد شرائح قشرة الأنف -entorhinal الأفقية (HEC) من الفئران التي تظهر نشاطًا عفويًا لموجة حادة. يتم احتضان الشرائح في غرفة احتجاز واجهة مبسطة ويتم تنفيذ التسجيلات في ظروف مغمورة مع السائل النخاعي الاصطناعي المتدفق بسرعة لتعزيز الأوكسجين الأنسجة والظهور التلقائي للنشاط على مستوى الشبكة.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين التحقيق في الآليات الكامنة وراء تذبذبات شبكة الحصين في مستحضرات شريحة دماغ الفأر الحادة. في هذا المستحضر ، يتم إجراء التسجيلات في ظل ظروف مغمورة في شرائح تولد تذبذبات شبكية تلقائية ، مما يسمح بإجراء التقنيات الدوائية والبصرية الوراثية ، وتصور التسجيلات أحادية الخلية. بالنسبة للتروية عبر القلب ، مباشرة قبل إخراج الفأر من غرفة الأيزوفلوران ، املأ غطاء طبق بتري بثلاثة إلى خمسة ملليمترات من محلول السكروز المبرد ، واملأ قاع طبق بتري بحوالي سنتيمتر واحد من محلول السكروز المبرد.

انقل الفأر المخدر بسرعة إلى وسادة الامتصاص اليسرى ، واستخدم ثلاث قطع من الشريط اللاصق لتأمين الأطراف الأمامية والذيل. باستخدام ملقط كبير من الأنسجة ومقص جراحي ، ضع الخيمة على الجلد وقم بعمل شق طولي من أسفل القص إلى أعلى الصدر. استخدم الملقط لسحب عظمة القص واستخدم المقص لقطع الحجاب الحاجز.

استخدم المقص لقطع القفص الصدري على كل جانب بحركة واحدة كبيرة نحو النقطة التي يلتقي عندها الطرف الأمامي بالجسم ، واستخدم الملقط لوضع الجزء الأمامي من القفص الصدري باتجاه الرأس. استخدم المقص لعمل قطع أفقي لإزالة الأضلاع تماما ، واستخدم الملقط لتثبيت القلب في مكانه أثناء إدخال إبرة نضح عيار 20 في البطين الأيسر. عندما تكون الإبرة في مكانها ، استخدم مقص تشريح صغير لعمل شق في الأذين الأيمن ، والسماح بإخراج الدم من الدورة الدموية.

لاستخراج الدماغ ، بعد قطع الرأس ، استخدم مقصا صغيرا لعمل قطعتين جانبيتين عبر الجمجمة باتجاه خط الوسط في مقدمة الجمجمة بالقرب من العينين ، وقم بعمل قطعتين إضافيتين على جانبي قاعدة الجمجمة. اغمر الرأس في طبق بتري الزجاجي ، واستخدم المقص للقطع على طول خط الوسط عبر طول الجمجمة بالكامل ، مع السحب بالمقص لتقليل الضرر الذي يلحق بأنسجة المخ الأساسية. استخدم ملقط الأنسجة الصغيرة لإمساك كل جانب من الجمجمة بإحكام ، ولرفع العظم لأعلى وبعيدا عن الدماغ لفتح الجمجمة مثل الكتاب.

باستخدام أصابع اليد اليسرى لإبقاء اللوحات من الجمجمة مفتوحة ، أدخل الملعقة الدقيقة أسفل الدماغ بالقرب من المصابيح الشمية ، واقلب الدماغ من الجمجمة إلى السكروز. استخدم الملعقة الدقيقة لقطع جذع الدماغ ، واغسل الدماغ لإزالة أي دم أو فراء أو أنسجة متبقية. استخدم الملعقة الكبيرة لنقل الدماغ إلى غطاء طبق بتري الزجاجي ، واستخدم نصف شفرة حلاقة ذات حدين لعمل قطع إكليلي في الجزء الأمامي من الدماغ ، بما في ذلك المصابيح الشمية.

بعد ذلك ، قم بعمل قطع إكليلي لإزالة المخيخ ، وقم بتطبيق مادة لاصقة cyanoacrylate على منحدر أجار. استخدم الملقط لتجفيف الدماغ لفترة وجيزة على قطعة من ورق الترشيح ، قبل وضع المنديل في المادة اللاصقة على منحدر الأجار ، بحيث يكون الجانب البطني لأسفل. ضع منصة التقطيع في غرفة التقطيع في ميكروتوم ، وقم بتغطية الإعداد بالكامل بمحلول السكروز المبرد.

استخدم الملعقة الكبيرة لتقليب بعض ملاط السكروز في الغرفة ، وإذابة أي سكروز مجمد وخفض درجة حرارة الخليط بسرعة إلى درجة إلى درجتين مئويتين. قطع شرائح بسمك 450 ميكرون بسرعة تقطيع 0.07 ملم في الثانية. عندما يتم تحرير كل شريحة ، استخدم ملقط الأنسجة الصغيرة ومشرط حاد لفصل نصفي الكرة الأرضية ، وقطع الأنسجة حتى تتكون الشريحة بشكل أساسي من الحصين والمناطق المحيطة بالحصين.

استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل الشرائح بشكل فردي إلى غرفة استرداد الواجهة التي تحتوي على aCSF دافئ. مع وضع الشرائح في واجهة aCSF والهواء ، ومع وجود غضروف مفصلي رفيع فقط من aCSF يغطي الشرائح. عندما يتم الحصول على جميع الشرائح ، أغلق الغرفة بإحكام للسماح للشرائح بالتعافي عند 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

في نهاية فترة التعافي ، ضع الغرفة على محرك مضبوطة على سرعة بطيئة لتعزيز دوران aCSF داخل الغرفة. لتسجيل إمكانات المجال المحلي ، املأ دورق 400 مل ب aCSF الفقاعي بالكربوجين ، وضع أحد طرفي أنبوب المضخة في الدرق. قم بتشغيل مضخة تمعجية بسرعة 8 إلى 10 ملليلتر في الدقيقة لتوجيه aCSF من دورق 400 مل إلى خزان ساخن ، ومن الخزان إلى غرفة التسجيل عند 32 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتثبيت الأنبوب لفترة وجيزة وإيقاف تشغيل المضخة لإيقاف التدفق مؤقتا. باستخدام ملقط دقيق ، انقل شريحة من أنسجة المخ إلى غرفة التسجيل بجوار زاوية ورق العدسة الذي تستقر عليه المنديل ، وقم بتقطيعه لأسفل. انزع ورق العدسة ، واترك الشريحة ظهرت في غرفة التسجيل ، واستخدم قيثارة لتأمين الشريحة.

باستخدام معالج دقيق يدوي، قم بدفع طرف ماصة التحفيز المملوءة بكلوريد الصوديوم ببطء إلى سطح الشريحة بزاوية 30 إلى 45 درجة، ثم استخدم مناور دقيق ثان لدفع طرف ماصة محتملة المجال المحلي المملوءة ب aCSf ببطء إلى منطقة الاهتمام بزاوية 30 إلى 45 درجة، وتسجيل إمكانات المجال المحلي للعينة وفقا للبروتوكولات القياسية. في هذا الشكل ، يمكن ملاحظة التسجيلات التمثيلية من شرائح القشرة المخية المخفية في الحصين ، المعدة وفقا للبروتوكول كما هو موضح. في الشرائح السليمة ، يجب أن ينتج التحفيز الكهربائي إمكانات ما بعد التشابك الميدانية مع تسديدة ألياف صغيرة قبل التشابك وإمكانات كبيرة بعد التشابك مع هبوط أولي سريع.

يجب أن تكون تموجات الموجة الحادة التلقائية مرئية أيضا على شكل انحرافات إيجابية في إمكانات المجال المحلي في الطبقة الهرمية. في الشرائح دون المستوى الأمثل ، تظهر إمكانات ما بعد التشابك الميدانية المستحثة وابلا أليافيا كبيرا ، وإمكانات صغيرة نسبيا بعد التشابك ، ولا تظهر هذه الشرائح تموجات موجة حادة تلقائية. تظهر تموجات الموجة الحادة في المختبر إمكانات مجال إيجابية في الطبقة الهرمية ، مع تذبذب متراكب عالي التردد مقترن بجهد مجال سلبي في طبقة الطبقة الرادياتوم.

كما هو موضح ، تنشأ تموجات الموجة الحادة في شرائح القشرة المخية الداخلية للحصين داخل الدوائر المتكررة CA2 / CA3 ، وتنتشر إلى CA1. من الضروري وضع الكربوجين في المحاليل طوال العملية ، لضمان تبريد محلول السكروز ، وتنفيذ كل خطوة في أسرع وقت ممكن. بعد تحضير هذه الشرائح ، يمكن إجراء تسجيلات خارج الخلية أو داخل الخلايا ، جنبا إلى جنب مع التجارب البصرية أو الدوائية لتحديد كيفية مساهمة أنواع الخلايا المختلفة في وظيفة الشبكات العصبية.