قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر طريقة لقياس وتصور إشارات FRET أو AMP الدورية في ثلاثة أبعاد مكانية في الخلايا الفردية. قد تحدث توزيعات AMP الدورية محوريا بالإضافة إلى أفقيا ومن المهم الحصول على بيانات صورة FRET AMP الدورية في ثلاثة أبعاد لأخذ عينات من هذه التوزيعات. في يوم التصوير ، يتدفق Tyrodes الدافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي ويركب زلة غطاء جالسة مع الخلايا المنقولة ذات الأهمية في غرفة الخلية.

قم بتأمين الجزء العلوي من الغرفة بحشية تثبيت لمنع التسرب واستخدم ممسحة مهمة دقيقة لإزالة أي خلايا متوسطة أو ملتصقة زائدة من أسفل زلة الغطاء. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل وأربعة ميكرولترات من الملصق النووي المكون من خمسة ملليمولار إلى حجرة الخلية وهز الغرفة برفق لمدة خمس إلى 10 ثوان. ثم قم بتغطية حجرة الخلية بورق الألمنيوم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لتصوير الخلايا ، حدد هدف الغمر في الماء 60X على مجهر متحد البؤر مزود بكاشف طيفي وأضف قطرة ماء إلى الهدف. ضع حجرة الخلية المحملة على مرحلة المجهر وقم بضبط مقبض المرشح لتحديد مجموعة المرشحات المناسبة. حدد وضع المجال العريض الفلوري واستخدم العدسات لتحديد مجال رؤية يحتوي على خلايا تعبر عن مستشعر FRET AMP الدوري.

افتح برنامج التصوير ، وحدد الوضع متحد البؤر ، وافتح زر التعشيق بالليزر. افتح قائمة الإعدادات A1. حدد المربعات المقابلة لخطوط الليزر 405 و 561 نانومتر واضبط هذه الاكتشافات الطيفية على SD ، والدقة على 10 ، والقنوات على 32.

حدد قيم الطول الموجي للبداية والنهاية لتعيين نطاق الطول الموجي. افتح قائمة إعدادات A1 لتحديد أيقونة تخطي التجميع. حدد مربع الرقم 15 وانقر فوق موافق. اضبط شدة الليزر على ثمانية بالمائة لليزر 405 نانومتر وإلى اثنين بالمائة لليزر 561 نانومتر.

اضبط كسب الكاشف على 149 ونصف قطر الثقب على 2.4 وحدة قرص متجدد الهواء. اضبط سرعة المسح الضوئي على 25 إطارا طيفيا في الثانية، وحدد اتجاه المسح أحادي الاتجاه. اضبط العد على أربعة وحجم المسح الضوئي إلى 1024 × 1024.

لتحديد معلمات اكتساب z-stack، انقر فوق View وAcquisition Control وND Acquisition، وأدخل وجهة الملف والاسم في النافذة المنبثقة لحفظ ملف ND. انقر فوق مربع z-series وانقر فوق Live في نافذة إعدادات A1 Plus لفتح نافذة عرض مباشر. اضبط مقبض التركيز البؤري للتركيز على الخلايا أثناء النظر في نافذة المعاينة.

اضبط مقبض التركيز البؤري على المجهر لتحديد الجزء العلوي من الخلية وانقر فوق أعلى في نافذة اكتساب الكثافة المحايدة لتعيين الموضع الحالي على أنه الأعلى. اضبط مقبض التركيز البؤري على المجهر لتحديد الجزء السفلي من الخلية وانقر فوق أسفل لتعيين الموضع الحالي في الأسفل. أدخل ميكرومتر واحد لحجم الخطوة.

حدد أعلى أسفل لاتجاه z-scan وانقر فوق تشغيل للحصول على z-stack. عند اكتمال اكتساب المكدس z، استخدم ماصة لإضافة الكاشف محل الاهتمام برفق إلى الغرفة دون إزعاج الخلايا. بعد 10 دقائق ، قم بتغيير اسم الملف والحصول على صورة z-stack ثانية.

بعد التصوير ، قم بإنشاء مجلدات جديدة بنفس أسماء الملفات مثل صور z-stack الطيفية وافتح ملف الصورة الطيفية محل الاهتمام. انقر فوق ملف واستيراد / تصدير مستند ND. في النافذة المنبثقة ، حدد المجلد الذي تم إنشاؤه حديثا ، TIFF لنوع الملف ، والصورة الأحادية لكل قناة ، واحتفظ بعمق البت.

انقر فوق تصدير لتصدير الملفات الفردية إلى المجلد وفتح برنامج فك الخلط الطيفي الخطي. افتح ملف إلغاء الخلط الخطي. m وانقر فوق تشغيل.

استعرض وحدد المجلد الذي يحتوي على تسلسل ملف TIFF الذي تم تصديره وانقر فوق موافق لفتح الطول الموجي ونافذة z-slice. انسخ اسم ملف الملف الأول بدون z-slice ورقم القناة من المجلد والصقه في الخطوة الأولى من المربع Enter of the imagename ، وأدخل عدد القنوات في مربع إدخال عدد نطاقات الطول الموجي ، وعدد الشرائح z في مربع أدخل عدد Z Slices وانقر فوق موافق. ثم في النافذة المنبثقة ، تصفح وحدد ملف الطول الموجي. mat وانقر فوق Open.

استعرض وحدد ملف المكتبة. mat في النافذة المنبثقة الجديدة وانقر فوق فتح مرة أخرى لبدء إلغاء خلط الشرائح. لحساب كفاءة FRET ، افتح multiFRRCF.

م برمجة البرنامج النصي وأدخل عدد التجارب التجريبية لتحليلها في مربع كم عدد المجلدات المراد إعادة تقطيعها. انقر فوق موافق. استعرض لتحديد المجلدات غير المختلطة وانقر فوق موافق مرة أخرى. في النافذة المنبثقة الجديدة ، اضبط عامل التحجيم على 12.4 ، والعتبة إلى 56 ، وتردد X و Y و Z إلى خمسة وخمسة وواحد على التوالي ، وخوارزمية التنعيم إلى Gaussian.

ثم انقر فوق تشغيل لإجراء قياسات FRET وإعادة التقطيع. لتعيين كفاءة FRET إلى مستويات AMP الدورية، افتح Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m وانقر فوق تشغيل.

انتقل إلى أول صورة FRET ذات تدرج رمادي وحددها وانقر فوق موافق. ثم افتح صور FRET AMP الدورية لفحص توزيع إشارات AMP الدورية في ثلاثة أبعاد. في هذه الصور, يمكن ملاحظة وجهات النظر ثلاثية الأبعاد لبيانات الصورة الفائقة الطيفية الملونة الكاذبة الملونة المكتسبة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر في خط الأساس و 10 دقائق بعد العلاج فورسكولين. في هذا التحليل ، تم تدمير الفلوروفور المستقبل بالكامل مما يسمح بالحصول على التوقيعات الطيفية للمتبرع والمتلقي مع القياس المتكافئ الفردي.

تم استخدام الخلايا غير المنقولة المسماة بصبغة نووية للحصول على الطيف النقي للصبغة الفلوروفورية. يسمح الجمع بين أطياف فلوروفورات المانحة والمتقبل والصبغة النووية بإنشاء مكتبة من ثلاثة مكونات. هنا ، يمكن ملاحظة مصادر ثلاثة توقيعات طيفية خلفية.

على الرغم من أن هذه الإشارات موزعة بشكل غير موحد داخل العينة ولا يمكن طرحها ببساطة ، فإن إضافة البصمات الطيفية لهذه الإشارات إلى المكتبة الطيفية واستخدام فك الخلط الخطي لفصل الإشارات يوفر نهجا لإزالة هذه الإشارات المربكة من إشارات المانحة والمستقبلة قبل حساب كفاءتها في FRET. يمكن بعد ذلك استخدام المكتبة الطيفية المكونة الستة لإجراء فك الاختلاط الطيفي الخطي لكل شريحة في الصورة المحورية. هنا, يمكن ملاحظة التغيرات في كفاءة FRET ومستويات أمبير الدورية في شرائح مختلفة من المستوى XY مما يسمح بإجراء مقارنة بين شروط خط الأساس والظروف بعد 10 دقائق من العلاج فورسكولين.

يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتحديد كفاءة FRET للمراسلين الآخرين في ثلاثة أبعاد في كل من الخلايا والأنسجة.