تحضير اللقاح المخصب بالفيروسات للعدوى الفموية لنحل العسل (Apis mellifera)

يوضح بروتوكولنا كيفية إنتاج جزيئات فيروس نحل العسل بشكل جماعي لاستخدامها في المقايسات الحيوية الخاضعة للرقابة وعالية الإنتاجية للفحص السريع لفعالية العلاج الفيروسي. يستخدم الاختبار شرانق النحل سهلة الاستزراع بدلا من زراعة الخلايا ، مما يقلل من عمالة الحصول على مواضيع تجريبية. يمكن بعد ذلك استخدام الفيروس لإنتاج منحنيات وفيات يمكن التنبؤ بها ومقايسات حيوية قابلة للتكرار.

كان هناك اهتمام كبير بفهم كيفية تأثير ما يسمى بفيروسات نحل العسل على نطاق أكبر من المضيف. يمكن إقران تقنية إنتاج الفيروس هذه بأنظمة الملقحات الأخرى لاختبار العدوى. لاستخراج النحل الجماعي عن طريق الإزالة الذاتية لليرقات ، قم بوضع ملكة نحل العسل في قفص على إطار لانجستروث فارغ وممتد وإعادتها إلى مستعمرتها.

بعد السماح للملكة بوضع البيض على الإطار لمدة 24 ساعة ، تحقق من الإطار للتأكد من أن معظم خلايا المشط تحتوي على بيض تم وضعه حديثا وإطلاق سراح الملكة. بعد 192 ساعة بالضبط من حبس الملكة في قفص ، قم بإزالة الإطار من المستعمرة وقم بتنظيف أي نحل بالغ. عند العودة إلى المختبر ، ضع الإطار في حاضنة مضبوطة على الظروف الداخلية للخلية ونظف الحاويات تماما بنفس ارتفاع وعرض الإطار المملوء باليرقات بالماء والصابون المتسلسل والمبيض وغسل الإيثانول.

قم بتبطين قاع الحاويات بعدة طبقات من المناشف الورقية وأضف عدة طبقات متداخلة من مادة ماصة أرق. عندما تكون الحاويات جاهزة ، ضع الإطار على جانب اليرقات البؤرية للحاوية لأسفل واستخدم قطعة من رقائق الألومنيوم المثبتة في الخيام لتغطية الحاوية والإطار. بعد الحضانة طوال الليل ، ارفع المناديل المبللة بعناية من الطبقة العليا من كل حاوية للسماح بسكب اليرقات برفق في صينية النقل.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا غير حاد وناعم لنشر اليرقات على سطح الصواني دون لمسها وضع الصينية المغطاة بورق الألمنيوم في الحاضنة حتى تتحول اليرقات إلى خادرتها وتنضج إلى مرحلة العين الواسعة. لحقن الشرانق بالفيروس، قم بخلط جزيئات الفيروس ذات الأهمية بالتركيز المناسب في PBS المعقم في أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتوصيل جهاز حاقن بماصة يدوية متعددة. لاختبار فعالية الحاقن ، قم بتحميل الحاقن ب 100 ميكرولتر من الماء وقم بتوزيع الماء بجرعات ميكرولتر واحد.

إذا كانت الحقن دقيقة ، فقم بتحميل 100 ميكرولتر من محلول جزيئات الفيروس في الحاقن وأمسك بخادرة واحدة برفق على طول الصدر ، مع الضغط على ما يكفي لإجبار السوائل الداخلية على الدخول في البطن لجعل انقسامات الترجيت أكثر وضوحا. قم بتثبيت الذراع التي تمسك المحقنة بمقعد المختبر للحصول على الدعم ، وأدخل الإبرة في بشرة بين الترجيت البطني الثالث والرابع وحقن ميكرولتر واحد من محلول الفيروس. عندما يتم حقن جميع الشرانق ، أعد تغطية الدرج بورق الألمنيوم قبل إعادة الشرانق إلى الحاضنة لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام أخرى.

في نهاية الحضانة ، قم بتجميع الشرانق حسب مصدر المستعمرة في أنابيب طرد مركزي مخروطية فردية سعة 50 مليلتر ودوامة لتجانس المحتويات. لإجراء اختبار حيوي للتغذية الفيروسية ، قم بتوصيل فتحات التغذية للأقفاص النظيفة بأنبوب طرد مركزي بحجم مناسب واملأ جزئيا أنابيب الطرد المركزي سعة 15 مليلتر بمحلول تغذية معد حديثا. بعد ذلك ، اقلب الأنابيب واستخدم دبوس الإبهام لعمل ثقب أو فتحتين حول الأطراف.

بعد ذلك ، قم بتنظيف كل النحل الذي ظهر حديثا من صناديق ظهوره في وعاء تجميع مغطى قليلا حول الحواف بالزيت النباتي واخلط النحل برفق يدويا. انقل 35 نحلة فردية إلى كوب واحد مدهون بالزبدة وضع محتويات الكوب في قفص أكريليك. لتحضير لقاح الفيروس ، قم بخلط كمية مناسبة من جزيئات الفيروس المذابة والمركزة مع محلول السكروز بنسبة 30٪ في حاوية واحدة معقمة لكل نوع معالجة وأضف 600 ميكرولتر من محلول الفيروس إلى صواني اللقاح الفردية.

بعد ذلك ، أدخل كل صينية لقاح بعناية في أقفاصها المقابلة ، مع الحرص على عدم إطلاق أي نحل عن طريق الخطأ. عند استهلاك جميع اللقاحات، استبدل أنابيب الطرد المركزي من فتحة التغذية العلوية بأنابيب التغذية المعدة وسجل معدل الوفيات داخل كل قفص كل 12 ساعة خلال أول 72 ساعة من التجربة وكل 24 ساعة بعد ذلك. لإزالة النحل الميت ، حرك باب القفص لأعلى بعيدا بما يكفي للسماح بإدخال زوج من الملقط المعقم بالكحول لإخراج النحل الميت.

اعتمادا على تصميم التجربة ، ضع عينات حية من كل قفص في أنابيب طرد مركزي فردية على الجليد الجاف للسماح بأخذ عينات لقياسات العيار الفيروسي. في هذا الجهد التمثيلي لحصاد الفيروسات الأكبر ، تم حقن كل خادرة في البداية بلقاح فيروس الشلل الحاد الإسرائيلي بنسبة 95٪. على الرغم من أن 10 من أصل 16 عينة مستعمرة شاركت في عمليات الاستخراج هذه تحتوي على فيروسات عالية النقاء ، إلا أن العينات الأخرى اختلفت في نسبتها الفيروسية ، حتى أن بعضها تهيمن عليه فيروسات أخرى ، مثل فيروس الجناح المشوه.

كما هو موضح في الجدول، يمكن استخدام قيم دورة العتبة كمؤشر للتناسب. تكشف مقارنة منحنيات الاستجابة للجرعة والبقاء على قيد الحياة لنحل العسل الذي يتغذى على نفس جزيئات الفيروس خلال عامين مختلفين أنه على الرغم من معايير الاختبار المتطابقة ، فإن التجارب التي أجريت في عامي 2018 و 2019 أنتجت استجابات مختلفة بشكل ملحوظ للبقاء على قيد الحياة في جميع مجموعات العلاج باستثناء مجموعات العلاج الضابط ، والتي لم تتلق أي فيروس في لقاح السكروز. يمكن أن تختلف استجابات نحل العسل للعدوى الفيروسية اختلافا كبيرا اعتمادا على الموسم أو الخلية أو حتى توزيع اللقاح داخل الأقفاص الفردية.

لذلك ، تعد أحجام العينات الكبيرة أمرا بالغ الأهمية لتأكيد تأثيرات العلاج. باستخدام مخزونات جزيئات الفيروس ، يمكن توسيع التجربة لتشمل حقن عمال نحل العسل البالغين أو الملكات أو الطائرات بدون طيار ، أو إلى أنواع أخرى من الملقحات لتقييم نطاق المضيف. يمكن استخدام المخزونات المعدية للفيروس لاختبار كيفية تفاعل العدوى مع عوامل أخرى ، مثل النظام الغذائي أو التعرض للمواد الكيميائية أو البيئات الاجتماعية.