مجهر القوة الذرية جنبا إلى جنب مع التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء كأداة للتحقيق في كيمياء البكتيريا الواحدة

تسمح الطريقة بإجراء دراسات نانوية للبكتيريا. يوفر لنا نظرة ثاقبة مفصلة على التغيرات الكيميائية في مقاومة مضادات الميكروبات. لذلك ، يمكن أن يساهم في فهمنا لمقاومة مضادات الميكروبات وتطوير الأدوية.

يحد الحجم النانوي للبكتيريا بشكل كبير من أدوات البحث المتاحة القادرة على استكشاف كيمياءها. يسمح لنا AFM-IR بالقيام بذلك بطريقة غير مدمرة ومستقلة عن المراقب ، حتى على المستوى الخلوي الفرعي. من خلال توفير نظرة ثاقبة لمقاومة مضادات الميكروبات ، يمكن أن تساعد الطريقة في تحديد واختبار الأهداف الجزيئية لمضادات الميكروبات الجديدة.

بالإضافة إلى البكتيريا ، يمكن ل AFM-IR فحص مجموعة من الخلايا والأنسجة وحتى الفيروسات. لتحضير عينة لتصوير AFM-IR ، بعد زراعة البكتيريا ذات الأهمية على الوسط المناسب في ظل ظروف الاستزراع المناسبة ، استخدم حلقة معقمة لاختيار البكتيريا بعناية من أعلى المستعمرات لنقلها إلى أنبوب زجاجي. أضف ملليلترا واحدا من الماء فائق النقاء إلى الأنبوب والدوامة لمدة دقيقة إلى دقيقتين حتى تختفي الحبيبات البكتيرية المجمعة في قاع الأنبوب.

تقدير التعكر التقريبي للمحلول من خلال المقارنة المرئية بين الحل المحضر ومعايير ماكفارلاند. إذا بدا أن تعكر المعلق البكتيري منخفض جدا ، فاستمر في إضافة المزيد من البكتيريا والدوامة حتى تصبح التعكر الخشن للمحلول قابلة للمقارنة مع معايير 0.5 و 1 McFarland. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي ، وشفط بعناية بالماصة.

قم بتعليق بيليه الخلية البكتيرية في مليلتر واحد من الماء عالي النقاء مع الدوامة ، وقم بترسيب البكتيريا بجهاز طرد مركزي آخر. بعد غسل البكتيريا حتى ثلاث مرات أخرى كما هو موضح للتو ، قم بشفط المادة الطافية ودوامة الحبيبات لمدة دقيقتين على الأقل قبل إضافة خمسة ميكرولترات من الخلايا إلى الركيزة التجريبية. إذا كان السماكة المطلوبة عبارة عن بكتيريا أحادية الطبقة أو بكتيريا فردية ، مباشرة بعد الترسيب ، أضف ما بين 20 إلى 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء إلى الركيزة واخلط المحلول برفق بطرف ماصة.

عندما تجف العينة بالهواء ، استخدم شريطا لاصقا على الوجهين لتركيب الركيزة على قرص عينة معدني AFM. لإعداد أداة التحليل الطيفي AFM-IR للتحليل ، اضغط على تهيئة بعد تشغيل البرنامج والليزر وتأكد من أن غالق الليزر في وضع الفتح. أثناء هذه العملية ، ستظهر نافذة تهيئة المرحلة.

عند انتهاء عملية التهيئة، انقر فوق تهيئة وموافق. إذا أمكن ، قم بتشغيل تدفق النيتروجين لتطهير الجهاز بالنيتروجين وضبط تطهير النيتروجين لتحقيق مستوى رطوبة مستقر. ضع العينة بعناية في غرفة العينة دون إتلاف الطرف وانقر فوق تحميل في البرنامج. اتبع المعالج لتحميل العينة، مع التركيز على الطرف والعينة في كل خطوة.

ثم انقر فوق نهج للاقتراب من العينة دون المشاركة. قبل إشراك العينة، حدد الأدوات ومعايرة خلفية الأشعة تحت الحمراء وجديد. في النافذة المنبثقة ، قم بتعيين الدقة والنطاق الطيفي وفقا للهدف من التحليل وقم بتعيين المتوسطات المشتركة والخلفيات على متوسط القيم.

حدد تمكين. في النافذة المنبثقة، قم بتعيين معلمات البداية والنهاية وانقر فوق قبول والحصول عليها. عند الحصول على بيانات الخلفية، انقر فوق حفظ.

لإشراك التلميح في النموذج، انقر على إشراك. سيقترب النظام من سطح العينة حتى يتم اكتشاف الاتصال المباشر. انقر فوق مسح ضوئي لتجميع مساحة أولية أكبر وصورة AFM منخفضة الدقة المكانية لتصور السطح قبل تحريك الطرف إلى نقطة قياس ذات اهتمام.

لمحاذاة ليزر الأشعة تحت الحمراء مع رقم الموجة الذي ستمتص فيه العينة ، أدخل رقم الموجة الذي ستمتص عنده العينة في حقل رقم الموجة ، وانقر فوق ابدأ IR.At يجب ملاحظة ذروة واضحة واحدة على الأقل في الرسم البياني للسعة مقابل التردد. يجب أن يظهر الرسم البياني للانحراف مقابل الوقت شكل موجة دورية. انقر فوق تحسين لتحديد طيف بكتيريا الأشعة تحت الحمراء التقليدي لتحديد مواضع النطاقات ، واستخدام الطيف لتحسين النقاط الساخنة بقيم أرقام موجة مختلفة من مناطق طيفية مختلفة.

عندما يتم تحسين بقع الأشعة تحت الحمراء لقيم أرقام الموجة المحددة ، حدد الدقة الطيفية والنطاق وعدد المتوسطات المشتركة وانقر فوق اكتساب لتجميع طيف AFM-IR. لتجميع صورة توزيع الشدة لقيمة رقم موجة محددة، بعد تسجيل طيف AFM-IR واحد، قم بتسجيل صورة AFM لمنطقة العينة المحددة وحدد قيم رقم الموجة لتصوير AFM-IR. تأكد من تحسين بقعة الأشعة تحت الحمراء لليزر لقيم رقم الموجة المحددة ، وقم بتعيين عدد نقاط البيانات في اتجاهي X و Y لمنطقة الصورة.

في النافذة العامة ، اضبط طاقة الليزر. في نافذة مسح AFM، حدد معدل الفحص. ثم حدد المربع تمكين تصوير الأشعة تحت الحمراء وانقر فوق مسح لبدء التصوير.

سيتم جمع AFM-IR لشدة الإشارة عند رقم الموجة المحدد في وقت واحد مع بيانات AFM من تلك المنطقة. يتيح هذا البروتوكول الحصول على مجموعة من أنواع توزيعات الخلايا البكتيرية على الركيزة ، من الخلايا المفردة إلى الطبقات الأحادية والمتعددة الطبقات. يمكن استخدام البروتوكول لمراقبة التغيرات الديناميكية في البكتيريا الحية.

على سبيل المثال ، في تكوين الحاجز أثناء انقسام الخلايا المكورات العنقودية الذهبية. تميز طيف AFM-IR للحاجز بكثافة نسبية أعلى للنطاقات عند 1 و 240 و 1 ، 090 سم مقارنة بأطياف AFM-IR التي تم جمعها من منطقة الخلية ، مما يشير إلى أن الحاجز يتكون من مجموعات الكربوهيدرات والفوسفوديستر من مكونات جدار الخلية. يمكن أيضا استخدام البروتوكول لدراسة الاختلافات في التركيب الكيميائي الناشئة عن تطور المقاومة.

كما لوحظ في هذا التحليل التمثيلي ، لم يتم قياس أي اختلافات مورفولوجية بين مقاومة الفانكومايسين المتقطعة وخلايا الفانكومايسين المكورات العنقودية الذهبية الحساسة. ومع ذلك ، كشف تقييم أطياف AFM-IR ومشتقاتها الثانية عن زيادة واضحة في الكثافة النسبية للنطاقات المرتبطة بمجموعات الكربوهيدرات والفوسفوديستر من مكونات جدار الخلية في السلالة المقاومة مقارنة بالنظير الحساس. من المهم تحضير عينة نظيفة ، لذا احرص على تقليل المساهمة المتوسطة من البداية وإزالتها تماما من الغسلات المتعددة.

نظرا لأن AFM-IR هي تقنية غير مدمرة ، يمكن دراسة العينة لاحقا باستخدام تقنيات أخرى ، مثل التلوين أو التحليل الطيفي الأيوني متحد البؤر ، والتي يمكن أن توفر معلومات مجانية حول كيمياءها.