MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

وقد تم تطوير تنقية MS2-affinity إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي أو MAPS لتحديد الهدف الكامل لأي الحمض النووي الريبي ذات الاهتمام في البكتيريا. هذه التكنولوجيا تجعل من الممكن تحديد أي نوع من الشركاء الجيش الملكي النيبالي بشكل مستقل عن آلية التنظيم. إن توصيف الشبكات التنظيمية المعتمدة على الحمض النووي الريبي سيساعد على فهم أفضل لإنتاج عوامل الفوعة، وتشكيل الأغشية الحيوية، وبقاء البكتيريا داخل الخلايا المضيفة، وفي نهاية المطاف مكافحة العدوى العنقودية.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي بكتيريا مسببة للأمراض أو غير مسببة للأمراض إيجابية الغرام. إثبات الإجراء سيكون نويمي مرسييه، طالب دكتوراه من مختبر الدكتور باسكال رومبي. للبدء، تنمو مستعمرة واحدة من سلالات تحمل إما pCN51 P3 MS2 sRNA أو pCN51 P3 MS2 البلازميدات في ثلاثة ملليلتر من BHI المتوسطة تكملها 10 ميكروغرام لكل ميكرولتر الاريثروميسين في التكرارات.

تمييع كل ثقافة بين عشية وضحاها في 50 ملليلتر من BHI المتوسطة الطازجة تكملها الاريثروميسين للوصول إلى OD 600 من 0.05. تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 180 دورة في الدقيقة لمدة ست ساعات. نقل كل ثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر والطرد المركزي الأنابيب في 2, 900 مرات G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية, ثم تجاهل supernatant, تجميد وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية أو الحفاظ على الكريات على الجليد وإجراء مباشرة تحلل الخلايا الميكانيكية.

لإجراء تحلل الخلايا الميكانيكية، وإعادة إنفاق الكريات في خمسة ملليلتر من العازلة A ونقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى 15 أنابيب الطرد المركزي ملليلتر مع 3.5 غرام من حبات السيليكا. أدخل الأنابيب في أداة تحلل الخلايا الميكانيكية وتشغيل دورة من 40 ثانية في أربعة أمتار في الثانية الواحدة. طارد الأنابيب في 2، 900 مرة G لمدة 15 دقيقة، ثم استرداد supernatant ويبقيه على الجليد.

تأكد من أن الفائق واضح ، وتكرار الطرد المركزي إذا لم يكن كذلك. قم بإزالة طرف العمود، ثم ضع عمودا لونيا في رف عمود واغسل العمود بالماء فائق النحافة. إضافة 300 ميكرولتر من راتنج اميلوز وغسل العمود مع 10 ملليلتر من العازلة A.Dilute 1، 200 picamoles من البروتين MBP-MS2 في ستة ملليلتر من العازلة A وتحميله في العمود.

غسل العمود مع 10 ملليلتر من A.Next العازلة، تنفيذ تنقية MS2-تقارب. تحميل الخلية lysate في العمود وجمع كسر التدفق من خلال في أنبوب جمع نظيفة. اغسل العمود ثلاث مرات بعشرة ملليلترات من العازلة A وجمع كسر الغسيل، ثم قم بتجسير العمود بمليلتر واحد من العازل E وجمع كسر elution في جزء صغير من ملليلتر اثنين.

الحفاظ على جميع الكسور التي تم جمعها على الجليد حتى استخراج الحمض النووي الريبي. استخدام ملليلتر واحد من كل كسر لاستخراج الحمض النووي الريبي. إضافة حجم واحد من الفينول إلى الحمض النووي الريبي وتخلط بقوة، ثم الطرد المركزي الخليط في 16، 000 مرة G لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية.

نقل المرحلة العليا إلى نظيفة اثنين من ملليلتر الميكروبيتر. إضافة حجم واحد من الكحول isoamyl الكلوروفورم وتكرار الطرد المركزي، ثم نقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد. إضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول البارد 100٪، وحجم 0.1 من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس في درجة الحموضة 5.2 ويترسب بين عشية وضحاها في ناقص 20 درجة مئوية.

في اليوم التالي، طارد الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 16، 000 مرة G وأربع درجات مئوية. إزالة الإيثانول ببطء مع ماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه. أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد والمطارد المركزي بنسبة 80٪ لمدة خمس دقائق.

تجاهل الإيثانول عن طريق الأنابيب ببطء، ثم تجفيف بيليه باستخدام مكثف فراغ لمدة خمس دقائق على وضع التشغيل. Resuspend بيليه في حجم مناسب من المياه فائقة البور. تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة الهدف RsaC في S.aureus.

تم تحديد العديد من الرنانات التي تتفاعل مباشرة مع RsaC باستخدام تكنولوجيا MAPS ، مما يكشف عن دورها الحاسم في الإجهاد التأكسدي والاستجابات المتعلقة بالمعادن. لتأكيد MS2 SRNA يبني وتصور نمط التعبير، تم حصاد الخلايا بعد ساعتين وأربع وست ساعات من النمو في المتوسط BHI. تم استخراج الحمض النووي الريبي وتم إجراء تحليل لطخة الشمالية باستخدام التحقيق DIG RsaC محددة.

ارتفع مستوى RsaC الذاتية بشكل ملحوظ بعد ست ساعات من النمو. والأهم من ذلك، كان مستوى MS2-RsaC 544 وMS2-RsaC 1، 116 مماثلا ل RsaC الذاتية في ست ساعات. تم تنفيذ تنقية التقارب وتم استخراج RNAs من استخراج الخام ، وتدفق من خلال ، وكسور elution في سلالة من النوع البري التعبير عن علامة MS2 وحدها وسلالة RsaC متحولة تعبر عن بناء MS2 - RsaC 544.

تم إثراء 1، 116 نيوكليوتيد طويلة RsaC الذاتية في كسر elution، ولكن تفاعلت بشكل غير محدد مع عمود تقارب بسبب طوله وهيكله الثانوي المعقدة. تم إثراء MS2-RsaC 544 بشكل كبير في كسر elution مما يدل على أنه تم الاحتفاظ به بنجاح من قبل بروتين الاندماج MS2-MBP. وكشف تحليل المعلوماتية الحيوية أهداف الحمض النووي الريبي المفترضة وفقا للتغيير أضعاف بين MS2 SRNA وMS2 السيطرة، مما يشير إلى أن سودا كان الهدف المفترض الأول.

تحليل لطخة الشمالية إجراء التحقيق DIG sodA محددة بعد تنقية MS2-affinity يظهر أن سودا كان بكفاءة شارك في إثراء مع MS2-RsaC 544 بالمقارنة مع عنصر التحكم MS2. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن إضافة علامة MS2 يمكن أن تؤثر على تأكيد SRNA أو استقراره أو وظيفته. وينبغي رصد ذلك بعناية.

MAPS يوفر لقطة من أهداف SRNA-RNA الاقتران. مزيد من التحقق التجريبي سوف كشف وظيفتها. هذه التقنية تمثل أداة قوية لبناء شبكات تنظيمية الحمض النووي الريبي في أي بكتيريا.