عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

ينتج عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون وتكاثرها عددا كبيرا من الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات النهائية والتقنيات التجريبية. الاستخدام الرئيسي المقصود للخلايا الشحمية المتمايزة في هذا البروتوكول هو المقايسات الأيضية مثل امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين ، وتكوين الدهون ، وتحلل الدهون المحفز. للبدء ، قم بإنشاء بيئة عمل معقمة عن طريق تطهير غطاء السلامة البيولوجية وجميع الأدوات.

ماصة ما يقرب من 10 ملليلتر من خمسة PBS عازلة في أربعة أطباق زراعة الخلايا 100 ملم. انقل عينة دهنية وزنها 50 جراما إلى أحد الأطباق واغسلها أربع مرات عن طريق نقلها بالتتابع عبر الأطباق الأخرى التي تحتوي على خمسة PBS. ثم انقل الأنسجة الدهنية المغسولة إلى طبق زراعة نظيف 100 ملم وفرمها جيدا باستخدام مقص أو ملقط معقم.

انقل مقطعا من واحد إلى ثلاثة سنتيمترات من الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر يحتوي على 13 ملليلترا من محلول كولاجيناز. شطف الأنسجة المتبقية من طبق الثقافة مع اثنين ملليلتر من عازلة كولاجيناز لضمان حجم إجمالي من 15 ملليلتر. امزج العينة جيدا باستخدام ماصة مصلية سعة 25 ملليلتر واحتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية على الروك لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

من أجل تحييد نشاط الإنزيم ، أضف 10 ملليلتر من وسط نمو ADSC في الأنبوب بعد الحضانة واخلطه جيدا مع ماصة لفصل أي مجاميع أنسجة. نقل الجزء السائل إلى أنبوب مخروطي معقم جديد 50 ملليلتر ، وترك الأنسجة الصلبة. اغسل المنديل ثلاث مرات باستخدام سبعة ملليلتر من اثنين من PBS ونقل السائل إلى الأنبوب الجديد.

بعد ذلك ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من 1X خلية الدم الحمراء أو محلول تحلل كرات الدم الحمراء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم اغسل الخلايا مرتين بإضافة خمسة ملليلتر من وسط نمو ADSC إلى الأنبوب والطرد المركزي لإزالة المادة الطافية.

بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الحبيبات في ملليلتر من وسط نمو ADSC وقم بترشيحها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر. شطف مصفاة مع اثنين ملليلتر إضافية من الوسط ونقل أربعة ملليلتر من التعليق إلى طبق ثقافة معقم 100 ملليلتر. شطف الأنبوب المخروطي مرتين بثلاثة ملليلتر من الوسط لجمع حجم إجمالي قدره 10 ملليلتر في طبق الثقافة.

راقب الخلايا المجمعة تحت مجهر مقلوب بتكبير 10X للتحقق من الخلايا العائمة. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة النسبية 100٪. لضمان عقم وسائط الاستزراع ، قم بتضمين لوحة مع الوسائط وحدها.

بعد 24 ساعة ، اعرض الخلايا تحت المجهر المقلوب للتحقق من التصاق الخلية. قم بإزالة الوسط واستبداله بوسط دافئ كل 48 ساعة حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 80 إلى 90٪. للانتشار ، قم بإزالة وسط النمو من خلايا ADSC المتقاربة واغسلها مرتين باستخدام ملليلتر من PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة.

قم بشفط PBS وأضف ملليلتر من 0.25٪ تربسين EDTA في كل لوحة استزراع ، تغطي كامل مساحة سطح اللوحة. احتضن الطبق لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، ثم قم بإزاحة الخلايا التربسينية ميكانيكيا عن طريق السحب بالقوة. أضف ملليلتر من وسط نمو ADSC واخلط الخلايا برفق.

نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، شطف الطبق مع اثنين ملليلتر إضافية من المتوسطة لضمان أقصى قدر من استعادة الخلية من اللوحة. بعد ذلك ، قم بجهاز طرد مركزي للأنبوب عند 500 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بصب المادة الطافية للحصول على حبيبات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة إلى ستة ملليلتر من وسط نمو ADSC لكل مليون خلية.

عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وقم بوضعها في طبقها كما هو موضح في مخطوطة النص. بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء، قم بشفط وسط النمو وشطف الخلايا بدرجة حرارة الغرفة المعقمة PBS، ثم أضف 10 ملليلتر من وسط تمايز ADSC. استبدل الوسيط كل ثلاثة أيام لمدة 14 إلى 21 يوما تقريبا.

راقب الخلايا لوجود قطرات دهنية تحت المجهر المقلوب عند تكبير 40X. يتم ملاحظة الخلايا الشحمية الناضجة بشكل عام بعد 14 يوما. في يوم الطلاء ، كانت ADSCs غير ملتصقة وتطفو في الثقافة.

أصبحت الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ بعد 72 ساعة وكانت جاهزة لتمايز الخلايا الشحمية. بعد 14 يوما من تمايز ADSC ، أظهرت الخلايا الشحمية الناضجة خصائص أديبوجينية قوية لوحظت تحت تكبير 40X. في اليوم 14 ، تم تلطيخ الخلايا وتثبيتها باستخدام Oil Red O و BODIPY لتصور قطرات الدهون.

يمكن ملاحظة الخلايا الشحمية المتمايزة تحت تكبير 20X. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم أن تتذكر أن بيئة العمل المعقمة أمر بالغ الأهمية للعزل الصحي ، والتوسع الكافي ، والتمايز الفعال للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام هذه الخلايا للعديد من المقايسات الأيضية مثل امتصاص الجلوكوز ، وتكوين الدهون ، وتحلل الدهون الذي يعد محورا رئيسيا لبحثنا.

تسمح هذه التقنية بالتحقيق في كيفية تأثير الكحول المزمن و SIV على القدرة الأيضية للخلايا الشحمية.