4D المجهري: كشف Caenorhabditis elegans التطور الجنيني باستخدام المجهر نومارسكي

الفحص المجهري رباعي الأبعاد أداة قيمة لإعادة بناء سلالة الخلية الكاملة لجنين C.elegans أو أي عينة أخرى على مستوى الخلية الواحدة. يمكن استخدام بصريات Nomarski لتسليط الضوء على تغيرات شكل الخلية أثناء التطور باستخدام مجهر قياسي والضوء المنقول دون الحاجة إلى المعدلة وراثيا أو الفحص المجهري الفلوري. يسمح المجهر رباعي الأبعاد بدراسة دورة الخلايا ، والانتشار ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج في C.elegans وفي أنظمة أخرى مثل الثدييات أو زراعة خلايا الأنسجة.

يتم تتبع نسب الخلية على صور DIC يدويا. يستغرق الأمر وقتا طويلا ويتطلب بعض الممارسة لإجراء تحليل كامل للأجنة. ستظهر الإجراء بيجونا إزكورا ، فنية في مختبرنا.

قبل تحضير الأجنة ، اضبط درجة حرارة تسجيل المجهر رباعي الأبعاد على 15 أو 20 أو 25 درجة مئوية واضبط المجهر على تسجيل 1 ، 500 ، 30 مستوى بؤري z-stacks على بعد ميكرون واحد مع فواصل زمنية 30 ثانية بين بداية كل كومة. بعد ذلك ، قم بنقل 500 إلى 1000 ميكرولتر من السائل 4.5٪ أجار في أنابيب زجاجية بحجم ثلاثة ملليمترات وقم بإغلاق الأنابيب بعناية بغشاء شمعي لتجنب الجفاف. لتحضير وسادة أجار رقيقة متجانسة للتسجيل ، قم بتسخين الأجار بعناية وتناوله فوق موقد الكحول حتى يذوب الأجار وضع الأنبوب في كتلة حرارة 80 درجة مئوية.

ضع شريحة مجهر زجاجي على قطعة من البلاستيك واستخدم ماصة المراعي بيد واحدة لوضع قطرة صغيرة من الأجار المذاب في وسط الشريحة ، ثم استخدم اليد الأخرى على الفور لوضع شريحة ثانية على قطرة الأجار لإنشاء وسادة أجار رفيعة جدا. لتركيب الأجنة ، أولا ، استخدم منتقي لنقل 5 إلى 10 خنثى الحمل إلى زجاج صانع ساعات مملوء بالماء تحت مجهر استريو. استخدم مشرطا لقطع الديدان الخيطية الخنثى واستخراج بيضة إلى أربع بيضات مبكرة من الرحم.

انزلق الشريحة العلوية برفق من وسادة أجار واستخدم أنبوبا شعريا لوضع بيضة مبكرة في وسط الوسادة. استخدم رمشا ملصوقا بنهاية عود الأسنان لضبط موضع البيضة حسب الضرورة، واستخدم الماصة الشعرية لإزالة أي ماء زائد. استخدم مشرطا لثني الغطاء ببطء وبشكل غير مباشر فوق المستحضر قبل استخدام ماصة دقيقة لملء 3/4 الفراغ المحيط بوسادة أجار بالماء.

ثم أغلق زلة الغطاء بالفازلين لتجنب الجفاف خلال فترات التسجيل الطويلة. بعد الختم ، ضع الشريحة على مرحلة المجهر رباعي الأبعاد واستخدم هدف تكبير منخفض لتركيز الجنين. حدد هدف الغمر 100X وقم بتركيز المكثف.

افتح فتحة المكثف بالكامل وأغلق الحجاب الحاجز الميداني لتوفير فتحة عددية أعلى ودقة أكبر. اقلب منشور ولاستون للحصول على صورة ثلاثية الأبعاد للجنين مضاءة على جانب واحد ، ثم أدر المنشور في الاتجاه الآخر للحصول على تأثير إضاءة الجنين على الجانب الآخر وابدأ التسجيل رباعي الأبعاد. لإعادة بناء نسب الخلية لجنين مسجل لفيلم 4D ، افتح برنامج تتبع النسب وحدد ملف ومشروع جديد.

حدد قالب نسب الخلية المناسب اعتمادا على درجة حرارة التسجيل واضبط عدد المسح الضوئي على 1500. الوقت بين عمليات المسح إلى 30 ثانية ، وعدد المستويات إلى 30 ، والمسافة بين المستويات إلى ميكرون واحد. حدد ملف الصورة والتنسيق والدليل حيث تم حفظ الصور.

حدد ما إذا كان قد تم حفظ الصور كصور مفردة أو كمكدسات z متعددة الصور وقم بتعيين تسمية الملفات وتنسيقات الصور. ثم انقر فوق تمكين معالجة القناة لاكتشاف وتعيين القنوات الضوئية المناسبة للفيلم 4D. لتتبع نسب الخلايا ، ابدأ برنامج تتبع نسب الخلايا.

ستظهر نافذة فيديو ونافذة نسب الخلية. في نافذة النسب ، حدد فرع النسب وانقر فوق نواة الخلية المقابلة لهذه الخلية في نافذة الفيديو. قم بتشغيل الفيلم 4D للأمام أو للخلف أو لأعلى أو لأسفل مستوى لمتابعة الخلية ذات الأهمية مكانيا بمرور الوقت.

انقر بشكل دوري على نواة الخلية لإنشاء نقطة في فرع النسب ولتسجيل الإحداثيات المكانية للخلية في وقت محدد. نتيجة لذلك ، من الممكن تقدم سلالة الخلية وإعادة بناء الجنين ثلاثية الأبعاد. ثم اضغط على مفتاح الإرجاع لتمييز الانقسام الفتيلي وحدد إحدى الخلايا الوليدة لمتابعة تقدم الخلية كما هو موضح للتو.

كرر التحليل لبقية الخلايا الجنينية لتتبع سلالة الخلية الكاملة أو لمتابعة خلايا معينة ذات أهمية، مثل تلك التي تخضع لموت الخلايا المبرمج. للسماح بمقارنة السلالات الطافرة ذات الأهمية مع سلالة خلية C.elegans النمطية من النوع البري. يتم تحضين الصفائح الدودية داخل صناديق من الورق المقوى لتجنب التكثيف.

بمجرد اكتمال التسجيل ، يمكن إعادة بناء سلالة الخلية باستخدام برنامج تتبع النسب كما هو موضح. على سبيل المثال ، في هذا التحليل التمثيلي ، تمت مقارنة سلالة الخلية الجنينية الطافرة gsr-1 التي تم تتبعها مع سلالة C.elegans البرية. وتم الكشف عن التأخير التدريجي في دورة الخلية أثناء التطور الجنيني.

نتيجة لذلك ، تم القبض على الأجنة الطافرة في مراحل متوسطة بينما تقدمت الأجنة البرية وفقست أخيرا على شكل يرقات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور السمات المهمة الأخرى للتطور الجنيني ، مثل موت الخلايا المبرمج ديناميكيا باستخدام الفحص المجهري رباعي الأبعاد. يجب معالجة تتبع النسب لصور DIC يدويا.

لا تكون المعالجة البرمجية للخلايا غير المميزة على الضوء المرئي في المراحل المبكرة من التطور دقيقة لتحليل الأجنة. إن تطبيق نظام التعرف على الصور في مجال الفحص المجهري للضوء المرئي سيؤدي إلى تقدم كبير في مجال البيولوجيا التنموي.