تصور الكالسيتونين الجينات ذات الصلة الببتيد المناعي الداخلي من الجرذ الجمجمة دورا ماتر مع Immunofluorescence والتتبع العصبي
يناير 6, 2021
هنا نقدم بروتوكولا لتصور الارتباط المكاني للببتيد الكالسيتونين ذات الصلة بالجينات (CGRP) - الألياف العصبية المناعية والأوعية الدموية في طرية الجمجمة باستخدام الفلورسينس المناعي والكيمياء الهستوكسية الفلورية مع CGRP و phalloidin ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، كان أصل هذه الألياف العصبية رجعيا مع تتبع عصبي فلوري.
قد يوفر هذا البروتوكول مرجعا منهجيا متغيرا لفهم البنية العصبية الوعائية المعقدة لمدرس الغور القحفي على الحالة الفسيولوجية أو المرضية. الاستفادة من شفافة جبل كامل دورا ماتر، يمكن أن تظهر الارتباط التشنجي من الألياف العصبية المناعية DURAL CGRP والأوعية الدموية في عرض 3D. بعد القتل الرحيم للفئران، تغلغلت عبر القلب مع 100 ملليلتر من 0.9٪ المالحة العادية تليها 250 إلى 300 ملليلتر من 4٪ paraformaldehyde في 0.1 العازلة فوسفات الضرس.
عند الانتهاء، قم بإزالة جلد الرأس وفتح الجمجمة لفضح دورة ماتر والجانب الظهري من الدماغ. تشريح الأم دورا الجمجمة على طول جذع الدماغ إلى لمبة الشم في نمط جبل كامل. شطف الطرية القحفية في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة لمدة دقيقة واحدة تقريبا واحتضانه في حل حجب.
نقل ماتر دورا في الأجسام المضادة للماوس CGRP بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، غسل الطرية ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة. احتضان ماتر دورا في حل مختلط من الحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية وphalloidin 568 في 0.1.
عازل فوسفات المولار يحتوي على مصل حمار طبيعي بنسبة 1٪ و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل ماتر دورا ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة، تقليم حواف، وجبل على الشرائح المجهر. وضع على غطاء زلات مع 50٪ الجلسرين قبل الملاحظة.
صورة جبل كله دورا ماتر مع المجهر الفلوري، ثم التقاط صور للألياف العصبية CGRP المناعي والأوعية الدموية phalloidin المسمى في ماتر دورا باستخدام المجهر confocal. حلق رأس الجرذ بشفرة حلاقة كهربائية، ثم ضع قضبان أذن حادة على الجرذ وضعه على الجهاز المجسم. وضع حامل الفم وتطبيق مرهم العيون على العينين.
تنظيف الجانب الجراحي من الجلد الرأس باستخدام الإيثانول 75٪، وجعل شق على طول خط الوسط من فروة الرأس. إزالة بلانتا periosteum والأنسجة العضلية بعيدا عن الجمجمة باستخدام القطن العقيم يميل التطبيقات. حفر حفرة صغيرة باستخدام حفرة بور مع بت تلميح جولة على العظام الجدارية والصدغية اليسرى فوق الشريان السحاري الأوسط.
بناء بنك حول الحفرة مع أسمنت سيليكات الأسنان وإضافة اثنين من microliters من الفلوروغولد في حفرة حول الشريان السحائي الأوسط مع microsyringe 10 ميكرولتر. غطي الثقب بقطعة صغيرة من إسفنجة الهيموستاتيكي. وضع قطعة من فيلم البارافين على الحفرة وختم حواف مع الشمع العظام.
خياطة الجرح مع الخيط العقيم. إبقاء الفئران في منطقة دافئة حتى أنها قد تعافى تماما. ثم أعد الجرذان إلى أقفاصها
بعد سبعة أيام البقاء على قيد الحياة، perfuse هذه الفئران مع 0.9٪ المالحة العادية تليها 4٪ paraformaldehyde في 0.1 العازلة فوسفات الضرس. تشريح TG وعنق الرحم 1-4 DRGs، ثم قطع لهم في سمك 30 ميكرومتر على نظام microtome cryostat في الاتجاه القوس. وجبل المقاطع على الشرائح الزجاجية المغلفة السيلان.
دائرة المقاطع مع قلم الهسوتشيماكيميكل واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حل حجب. نقل العينات إلى حل أرنب المضادة للفلوروغولد والفأر المضادة CGRP الأجسام المضادة واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اغسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 عازل فوسفات الضرس.
احتضان المقاطع المغسولة في حل مختلط من الحمار المضادة للأرانب اليكسا فلور 594 والحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية. ثم غسلها ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة وتطبيق زلات الغطاء مع 50٪ الجلسرين للمراقبة. التقاط صور للخلايا العصبية الفلوروغولد المسمى في TG وDRGs تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام المجهر الفلوري.
ثم، التقاط صور للفلوروغولد وCGRP وصفت الخلايا العصبية في TG وDRGs. بعد immunofluorescent والفلورسنت تلطيخ الهستهوتشيما مع CGRP وphalloidin، CGRP الألياف العصبية المناعية وphalloidin المسمى الشرايين الجافية والأنسجة الضامة تم تصورها بوضوح في جميع أنحاء جبل كامل الجمجمة دورا ماتر في نمط 3D. تعمل الألياف العصبية المناعية السميكة والرقيقة CGRP بالتوازي مع الشرايين الجافية حول جدار الأوعية الدموية أو بين الأوعية الدموية.
بعد سبعة أيام من تطبيق الفلوروغولد على منطقة الشريان السحائي الأوسط ودرا ماتر الجمجمة الجرذ ، تم الكشف عن الخلايا العصبية المسماة بالفلوروغولد في TG وDRGs عنق الرحم على الجانب ipsilateral من تطبيق التتبع ، والذي لوحظ مباشرة تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية للتنظير الدقيق الفلوري. تم العثور على الخلايا العصبية المسمى فلوروغولد في جميع الفروع الثلاثة من TG، مع تركيزات أعلى على أقسام العيون والفك العلوي ومع تركيزات أقل على الانقسام الفك السفلي. كما لوحظت بعض الخلايا العصبية المسماة بالفلوروغولد في عنق الرحم من اثنين إلى ثلاثة من مجموعات DRGs.
هذه الصور ممثل immunofluorescences مزدوجة تظهر الخلايا العصبية الحسية في TG وDRG. الخلايا العصبية المسماة مع FG، CGRP، وكل من FG و CGRP تم تصورها عن طريق الفلورة المناعية المزدوجة. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر تشريح خارج الجافية الجمجمة تماما ولصقه على شريحة في نمط جبل كامل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لتصوير الارتباط المكاني بين الألياف العصبية المتميزة مناعياً للببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين (CGRP) والأوعية الدموية في الأم الجافية القحفية باستخدام التألق المناعي. تتضمن هذه الطريقة تطبيق مقتف عصبي فلوري للتتبع الرجعي لفهم البنية العصبية الوعائية بمزيد من التفصيل.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التفاعلات العصبية الوعائية
- تقنيات التألق المناعي
خلفية علمية
- يُعد فهم التراكيب الوعائية العصبية أمراً بالغ الأهمية في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية.
- يُعتبر CGRP ببتيداً عصبياً هاماً يشارك في تنظيم الألم والأوعية الدموية.
- يعزز التصوير ثلاثي الأبعاد للألياف العصبية والأوعية الدموية استيعاب التفاعلات فيما بينها.
الهدف من الدراسة
- لتوفير مرجع منهجي لتحليل التفاعلات بين CGRP والأوعية الدموية في الأم الجافية القحفية.
- لاستخدام تحضير شامل شفاف من أجل تصور أفضل للارتباط المكاني.
- لتتبع أصل الألياف العصبية التي تغذي الأم الجافية.
الطرق المستخدمة
- تألق مناعي للحامل الكامل للأم الجافية القحفية.
- استخدام نموذج جرذ بعد القتل الرحيم والتروية لتحضير الأنسجة.
- حضن الأم الجافية القحفية مع أجسام مضادة محددة لتصوير الألياف العصبية والأوعية الدموية.
- استخدام مجهر بؤري (confocal microscope) لتصوير والتقاط الهياكل المحددة بفلورية.
النتائج الرئيسية
- يتيح هذا البروتوكول تصوراً واضحاً للألياف العصبية التفاعلية مناعياً لـ CGRP جنباً إلى جنب مع الأوعية الدموية المحددة بالفالويدين.
- يكشف التألق المناعي المزدوج عن التنظيم المكاني وأنماط توزيع الخلايا العصبية المحددة في العقد الثلاثتائية (TG) وعقد الجذور الظهرية الرقبية (DRGs).
- وُجدت تركيزات أعلى من الخلايا العصبية المحددة بعد التطبيق الموجه للمقتفي، مما يشير إلى فعالية منهجية التتبع.
الاستنتاجات
- تتيح هذه الدراسة فحصاً تفصيلياً للتفاعلات العصبية الوعائية في الأم الجافية القحفية، مما قد يفيد الأبحاث المستقبلية حول الألم والتنظيم الوعائي.
- تساعد الرؤى المنهجية في فهم تخطيط العصبونات الحسية في نماذج دراسية متنوعة.
- تمتد الآثار المترتبة على هذه الدراسة لتشمل الأبحاث المتعلقة بالحالات العصبية التي تلعب فيها الديناميكيات العصبية الوعائية دوراً محورياً.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول رسم خرائط تفصيلية للتوزيع العصبي الحسي المتفاعل مناعيًا مع CGRP وعلاقته المكانية بالأوعية الدموية في الأم الجافية القحفية، مما يدعم التحقق من الأهداف في علاجات الشقيقة والصداع. ومن خلال الجمع بين التألق المناعي، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتتبع الارتجاعي، يوفر هذا البروتوكول تقليلًا للمخاطر الميكانيكية للأهداف الوعائية العصبية المشاركة في إشارات الألم. ويوفر هذا النهج ثقة تنبؤية في تقييم ارتباط الهدف وتعديل المسار في النماذج قبل السريرية للاضطرابات الوعائية العصبية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الأصل التشريحي وتوزيع العصبونات الحسية التي تعبر عن CGRP للتحقق من مسارات العصب ثلاثي التوائم والعقد الجذرية الظهرية العنقية كأهداف علاجية.
- القيمة التشغيلية: تتيح التحقق الوظيفي من الهدف عن طريق ربط أنماط الألياف المفاعلة مناعياً لـ CGRP مع الشبكات الوعائية في تحضير جراحي للسحايا ذي صلة فسيولوجياً.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يعمل على تحضير عينات معيارية من كامل غشاء الأم الجافية (dura mater) للتقييم الكمي للتوضع المشترك للأعصاب والأوعية الدموية وكثافة التعصيب.
- القيمة التشغيلية: يدعم تكرار المقايسة من خلال التثبيت الشفاف للأنسجة والتصوير ثلاثي الأبعاد، مما يسهل الحصول على قراءات متسقة عبر الدفعات التجريبية المختلفة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يرسم خرائط لأصول العصبونات الموجبة لـ CGRP في العقد الثلاثمورق والعقد الجذرية الظهرية العنقية، مما يسمح بمواءمة المؤشرات الحيوية الترجمية لمسارات استشعار الألم في السحايا.
- القيمة التشغيلية: يوفر نظاماً ذا صلة بالمرض لتقييم تأثيرات تعديل الهدف على التفاعلات الوعائية العصبية في نماذج الألم قبل السريرية.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تتكامل هذه الطريقة ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر من خلال توفير بيانات تشريحية ووظيفية تساهم في تحديد الأهداف وفهم الآليات قبل البدء في جهود تحديد المركبات الرائدة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمسارات إشارات الأوعية الدموية العصبية التي يتوسطها CGRP في الأم الجافية.
- الفحص: يتيح جاهزية المقايسة من خلال التصوير القياسي للعلاقات المكانية بين الألياف العصبية والأوعية الدموية.
- التحليلات: يُنتج مخرجات تصوير كمية حول أنماط التعصيب وتوزيع الخلايا العصبية المحددة بالكاشف لتحليل الحالات المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بيانات تعصيب الأم الجافية بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تحديد أجسام الخلايا العصبية في TG و DRGs.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لرسم الخرائط الوعائية العصبية يمكن تطبيقها على أهداف ببتيدية عصبية متعددة ونماذج مرضية مختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في التعصيب الحسي للجافية.
- القيمة التشغيلية: تقديم تحضير معياري وقابل للتكرار للأنسجة والتصوير لضمان توافق الفرق متعددة الوظائف.
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير وضوح تشريحي لمواقع ارتباط الهدف في الفسيولوجيا المرضية للصداع.
- التأثير على المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لمعدلات مسار CGRP بناءً على ارتباط الهدف الوعائي العصبي الذي تم التحقق منه.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التشريح العصبي التشريحي، والوسم بالفلورة المناعية، والمجهر البؤري.
- يعتمد على إمكانية الوصول إلى المقطاع الدقيق (microtome)، والمجمد المقطعي (cryostat)، وبنية تحتية للتصوير الفلوري لتحليل العينات الكاملة والمقاطع.
- يستلزم توحيد بروتوكولات إيصال المقتفيات والتروية عبر المختبرات لضمان نتائج تتبع قابلة للتكرار.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند تطبيق الطريقة على أنواع مختلفة أو تحضيرات جافية متأثرة بالأمراض.
- تشمل القيود العملية تباين شفافية الأنسجة وقيود انتشار المقتفيات التي تؤثر على دقة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
