تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

كما FAPs هي وسطاء لتجديد العضلات والتليف المرضي، بروتوكولنا يسمح لتوصيف ديناميات FAP آخر إصابة العضلات وعزل FAPs للدراسات في المختبر أو الجسم الحي السابق. وحتى الآن، أجريت دراسات حصرا على ال FAPs المعزولة عن الفئران. بروتوكولنا يتيح العزل الفعال للFAPs من الفئران أكبر، وتوفير توافر الأنسجة أكبر بكثير لالفراعات المصب.

يمكن أن يؤثر وقت معالجة الأنسجة المطول سلبا على صلاحية FAPs. إذا تم معالجة عينات متعددة في وقت واحد، فمن المستحسن أن اثنين من المشغلين تنفيذ البروتوكول جنبا إلى جنب لتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلية المعزولة. ابدأ بوضع أنسجة العضلات المحصودة في طبق زراعة خلايا معقم طوله 10 سنتيمترات.

المسيل للدموع بلطف و فرم الأنسجة مع ملقط وإزالة النسيج الضام للحصول على ما يقرب من ثلاثة إلى أربعة ملليمتر قطع مكعبات. نقل الأنسجةمنستر إلى أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر تحتوي على ستة ملليلتر من DMEM و 1٪ البنسلين-streptomycin. بعد ذلك، قم بتنشيط 365 ميكرولتر من محلول كولاجيناز II بإضافة 10 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم 300 ملليمولار.

أضف محلول الكولاجيناز II المنشط إلى ملاط الأنسجة لتركيز نهائي قدره 250 وحدة لكل ملليلتر. احتضان الأنابيب في شاكر لمدة ساعة واحدة وعلى 37 درجة مئوية في 240 × ز مع الانفعالات اليدوية كل 15 دقيقة لطرد الأنسجة انضمت إلى جانب الأنبوب. بعد ساعة واحدة من الحضانة، أضف 100 ميكرولتر من الكولاجينز الثاني و50 ميكرولتر من التفكيك إلى العينة.

ثم، عينات ماصة 15 إلى 20 مرة مع ماصة المصلية حتى الحل هو متجانسة. احتضان العينة مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 240 × ز مع الانفعالات اليدوية كل 15 دقيقة. قص عينات محلول العضلات ببطء من خلال حقنة 20 ملليلتر مع إبرة قياس 20 لمدة 10 دورات.

ثم ضع مصفاة خلايا 40 ميكرون على أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر ورطب عن طريق أنابيب خمسة ملليلترات من DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين. ماصة العينة ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال مصفاة. بمجرد تصفية العينة بأكملها ، اغسل مصفاة الخلايا مع DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ البنسلين -streptomycin ليصل إجمالي حجم العينة إلى 25 ملليلتر.

تقسيم حجم العينة بالتساوي إلى أنبوبين مخروطيين 15 ملليلتر والطرد المركزي في 15 درجة مئوية، 400 × ز لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، يستنشق الناطق الخارق ويعاد إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من حاجز تحلل RBC في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. ثم أضف تسعة ملليلترات من مخزن الغسيل المؤقت ليصل الحجم إلى 10 ملليلترات وأجهزة طرد مركزي عند 15 درجة مئوية، 400 × غرام لمدة 15 دقيقة.

بعد الطرد المركزي، يستنشق الفائقة وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من العازلة غسل. نقل حجم مناسب من الخلايا إلى أنبوب طرد دقيق منفصل 1.5 ملليلتر ومزجه مع صبغة زرقاء تريبان. عد الخلايا الحية على المجهر الخفيف باستخدام مقياس الدم.

بالنسبة لقياس التدفق الخلوي، قم بنقل 1 إلى 2 مليون خلية لكل عينة تجريبية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر. جلب حجم العينة إلى ملليلتر واحد مع عازلة غسل، ووضع الأنبوب على الجليد. إعداد كافة عناصر التحكم للتجربة.

لضوابط الخلية، aliquot 500، 000 إلى 1 مليون خلية في ملليلتر واحد من العازلة غسل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر ووضعه على الجليد. إذا كان يجري إجراء التجربة للمرة الأولى، ينبغي أيضا أن تدرج تعليق خلية واحدة ملطخة. لإعداد عناصر التحكم في الخرز، أضف حوالي 150,000 حبة تعويض إيجابية إلى كل أنبوب طرد مركزي يحمل علامة 1.5 ملليلتر.

قم بإعداد التحكم في قابلية البقاء عن طريق نقل نصف حجم الخلية من أنبوب الجدوى لتحديث أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر المسمى ميت. احتضان الأنبوب الميت في 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، ثم وضعه على الجليد. بعد الحضانة، أعد الخلايا الميتة إلى أنبوب البقاء.

الطرد المركزي تعليق خلية واحدة، بما في ذلك عينات تجريبية والتحكم في 500 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وإعادة تعليق الكريات الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة غسل بعد أسبيراتينغ supernatant. إضافة الأجسام المضادة وفقا للسيطرة أو حالة تجريبية، ونفض الغبار بلطف العينة لضمان الاختلاط الكامل. ثم، احتضانهم على الجليد في الظلام لمدة 15 دقيقة.

للحصول على تعويض الخرز، واحتضان أنبوب في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. جلب حجم كل عينة إلى ملليلتر واحد عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى تعليق خلية واحدة، و 900 ميكرولتر من PBS للحصول على تعويض عناصر التحكم حبة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة في 500 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وضوابط حبة التعويض في 300 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد الطرد المركزي للعينات، يستنشق الفائقة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 300 ميكرولتر من العازلة غسل، والخرز الضوابط في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 150،000 حبة تعويض سلبي. الحفاظ على عينات الخلية على عينات الثلج والخرز في درجة حرارة الغرفة تحت رقائق الألومنيوم. المضي قدما في اكتساب قياس التدفق الخلوي من خلال وضع استراتيجية gating لتحديد السلف الليفية الدهنية والذرى الميوجينية.

في التحليل التمثيلي ، تم تأكيد اقتران ناجح للأجسام المضادة Sca-1 APC مع تلطيخ واحد من حبات التعويض وتعليق الخلايا المتولدة عن عضلة المعدة والأمعاء الجرذ السليمة. تم تبليك خمسة تركيزات مختلفة من Sca-1 APC على تعليق خلية واحدة ، وتم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة استنادا إلى أكبر كثافة مضان مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. تم إجراء تحديدات التدفق الخلوي ل FAPs و أعضاء البرلمان في gastrocnemius الفئران باستخدام استراتيجية gating هو مبين هنا.

تم فتح بوابات العينات لأول مرة لاستبعاد الحطام في عد الخرز. ثم تم بوابات الخلايا لاستبعاد doublets من قبل كل من الخصائص التشتت الأمامية والجانبية المتناثرة. تم تقييم صلاحية الخلايا الناتجة عن طريق التلطيخ مع SYTOX Blue.

تم تقييم SYTOX Blue المفردات السالبة لCD31 و CD45 لاستبعاد لين + كسور. تم تقييم سكان لين. تم تعيين الخلايا التي كانت إيجابية واحدة لSca-1 FAPs ، وتم تعيين الخلايا التي كانت إيجابية واحدة لVCAM-1 أعضاء البرلمان.

مع وجود نقص المناعة مباشرة بعد الفرز ، أظهر السكان المعزولون حديثا من FAPs تلطيخا إيجابيا ل PDGFRalpha دون أي تلوث من قبل الخلايا الإيجابية Pax7. على العكس من ذلك ، فإن السكان فرزها من أعضاء البرلمان ملطخة إيجابية لP PAX7 مع عدم وجود خلايا PDGFRalpha إيجابية. أظهرت FAPs الخلايا الليفية والخلايا الدهنية المتمايزة في اليوم 12 في وسائط التمايز الدهنية مع التعبير عن البروتين الخاص بالخلايا الليفية 1 وبيريليبين 1 ، على التوالي.

كان وجود الدهون الثلاثية والدهون المحايدة من الخلايا الدهنية الناضجة واضحا مع تلطيخ الزيت الأحمر O. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت FAPs وجود الكولاجين من النوع الأول وعدم وجود خلايا الخلايا العضلية الملوثة. أظهر أعضاء البرلمان الذين يزرعون في وسائل الإعلام التمايز العضلي في اليوم 12 وجود الخلايا العضلية الناضجة وانصهرت myotubes متعددة النوى، وكانت واضحة من الخلايا الليفية وتلوث الخلايا الدهنية.

عند استخدام هذه التقنية لعزل الخلايا الحية للثقافة على المدى الطويل، يجب على الباحثين التأكد من استخدام تقنية العقيم مع العمل في وقت واحد بكفاءة لضمان بقاء الخلايا الجيدة.