القياس الكمي لآثار مضادات الميكروبات على بنية الأغشية الحيوية في المختبر باستخدام برمجيات COMSTAT

تكمن أهمية هذا البروتوكول في أنه يوفر إطارا بسيطا وقابلا للتكرار لقياس هياكل الأغشية الحيوية في المختبر في ظل ظروف مختلفة مضادة للميكروبات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد في القضاء على الاختلافات الذاتية المرتبطة بالتشغيل اليدوي ل COMSTAT ، مما يسهل في النهاية توحيد وشفافية التجارب عبر مراكز البحوث. لتصوير مزارع Pseudomonas aeruginosa ، ضع اللوحة على مسرح المجهر متحد البؤر ، المجهز بأطوال موجات الإثارة بالليزر المناسبة ومجموعات المرشحات.

واستخدم عدسة غمر في الماء من 20 إلى 25 ضعفا لالتقاط ست طبقات على الأقل من صور z-stack من الطبقة السفلية إلى أعلى كل جزء من الأغشية الحيوية بزيادات قدرها 0.3 ميكرومتر. ثم احفظ الصور كملفات OME-TIFF لتحليل COMSTAT. عند الحصول على جميع الصور ، افتح حزمة COMSTAT2 في ImageJ وقم بإنشاء مجلد مصدر على سطح المكتب.

أضف OME-TIFF واحدا إلى المجلد وافتح OME-TIFF من المجلد المصدر. احذف أي طبقات فارغة لا تحتوي على كتلة حيوية. حدد File وImport وImage Sequence لاستيراد الملف إلى ImageJ.

حدد موقع المجلد المصدر وقم بتمييزه دون فتحه وانقر فوق تحديد. ستظهر نافذة خيارات التسلسل ، انقر فوق موافق. حدد الصورة والتحويل والوجه Z لقلب اتجاه الأغشية الحيوية بحيث تكون الطبقة السفلية في الجزء العلوي من المكدس. لتحديد خصائص الصورة، حدد الصورة والخصائص، ستظهر نافذة مصدر.

حدد وحدة الطول على أنها ميكرون، وحدد عمق فوكسل على أنه 0.3، وانقر فوق OK. حدد الصورة والضبط والحد. لضبط عتبة الصورة في نافذة الحد، ضع شريط التمرير السفلي في أقصى اليمين لتعيين الحد الأقصى لقيمة الحد الأقصى يدويا واستخدم شريط التمرير العلوي لتعيين الحد الأدنى. ثم استخدم شريط التمرير في نافذة الصورة للتمرير عبر كل طبقة للتأكد من إزالة ضوضاء الخلفية بشكل كاف في جميع أنحاء المكدس، وحدد Set لإصلاح قيمة الحد الأدنى.

في نافذة تعيين مستويات الحد، حدد موافق، وقم بتعيين الحد الأقصى لقيمة الحد الأقصى وإصلاحها بالمثل. حدد تطبيق، وانقر فوق موافق في نافذة تحويل المكدس إلى ثنائي التي تظهر، واخرج من نافذة الحد. حدد الإضافات والتنسيقات الحيوية ومصدر التنسيقات الحيوية لحفظ الملف باسم ملف جديد في المجلد المصدر.

ستظهر نافذة ملفات متعددة لمصدر التنسيقات الحيوية ، حدد موافق. ستظهر نافذة خيارات مصدر التنسيقات الحيوية ، حدد موافق مرة أخرى. لتشغيل COMSTAT ، حدد المكونات الإضافية و COMSTAT2 ، ستظهر نافذة حول ، حدد OK.In نافذة الدلائل المرصودة ، حدد إضافة ، حدد موقع المجلد المصدر وقم بتمييزه ، وقم بتمييزه وانقر فوق اختيار. ستظهر نافذة الصور في الدلائل التي تسرد OME-TIFFs المراد تحليلها.

في نافذة COMSTAT2.1 ، قم بإلغاء تحديد طريقة Automatic Thresholding Otsu و Connected Volume Filtering للتأكد من أن البرنامج يستخدم قيم عتبة محددة مسبقا لملفات OME-TIFF الفردية. في النافذة COMSTAT2.1 ، حدد الكتلة الحيوية وتوزيع السماكة ومساحة السطح ، وانقر فوق انتقال لتشغيل البرنامج. سيتم عرض بيانات الإخراج في نافذة السجل.

سيتم حفظ القياسات تلقائيا كملفات TXT في المجلد المصدر. في هذا التحليل التمثيلي ، تم استخدام عزلة Pseudomonas aeruginosa ، المزروعة من مريض التليف الكيسي المصاب ، لإثبات نقاط القوة في هذا النهج ، وتحديد التغيرات المستحثة بمضادات الميكروبات بشكل غير دقيق في بنية الأغشية الحيوية في المختبر. يمكن أن يتصور تصوير الخلايا الحية أيضا التغييرات في بنية الأغشية الحيوية الزائفة الزنجارية قبل وبعد العلاج أحادي النسيلة والتوبرامايسين الخاص بالأغشية الحيوية.

كشف تحليل بيانات COMSTAT عن اختلافات ذات دلالة إحصائية بين هياكل الأغشية الحيوية المعالجة مقارنة بمزارع التحكم. في المزارع المعالجة بتوبرامايسين ، لوحظ انخفاض واضح في متوسط السماكة والكتلة الحيوية. ومع ذلك ، في وجود الأجسام المضادة ، كان الأغشية الحيوية P.aeruginosa مقاومة لهذه التغيرات الهيكلية التي يسببها التوبراميسين.

عند فحص نسبة السطح إلى الحجم الحيوي ، لوحظ انخفاض كبير في وجود الأجسام المضادة في كل من الأغشية الحيوية المعرضة للتوبراميسين وغير المكشوفة ، مما يشير إلى تكوين الركام في الثقافات المعالجة بالأجسام المضادة. يمكن إجراء هذا الإجراء لتقييم أو مقارنة تأثيرات مضادات الميكروبات المختلفة المستخدمة لتعطيل مصفوفات الأغشية الحيوية كميا. باستخدام هذه التقنية كإطار عام ، يمكن للباحثين استكشاف طرق مختلفة لتحسين البروتوكول لتضمين نماذج رياضية جديدة ومكونات إضافية خوارزمية في ImageJ لتصوير عدم تجانس الأغشية الحيوية بشكل أفضل.