العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

ستسمح هذه التقنية للباحثين بعزل الخلايا الجذعية لسرطان الثدي بأقصى قدر من النقاء والجدوى لأداء كل من فحوصات التوصيف الوظيفي في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن أيضا استخدام الخلايا الجذعية المعزولة لسرطان الثدي للمساعدة في توضيح الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الورم والورم الخبيث ، ولتصميم استراتيجيات علاجية لاستهداف هذه الخلايا. مع التعديلات الطفيفة الخاصة بأنواع الخلايا والأنسجة ذات الأهمية ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على أنظمة أخرى.

لتوليد معلق خلية واحدة من ثقافة الخلايا ، اغسل مزرعة خلايا سرطان الثدي المتجمعة بنسبة 80٪ باستخدام PBS وعالج الخلايا بمحلول مناسب لتفكك الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بمجرد انفصال الخلايا ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الزراعة لتحييد محلول تفكك الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS للعد.

بعد العد ، قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، ثم أعد تعليق الخلايا مرة واحدة من 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر من مخزن الركيزة ALDH. لتوليد معلق خلية واحدة من عينة من الأنسجة ، استخدم الشفرات الجراحية في تقنية التقاطع لفرم أنسجة الورم إلى قطع بحجم ملليمتر واحد تقريبا. ضع القطع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 ملليلتر من المخزن المؤقت للتفكك.

أغلق الأنبوب بالبارافيلم لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية في شاكر وقم بترسيب قطع الأنسجة المهضومة عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من التربسين باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر واحتضان الأنسجة في حمام مائي بزاوية 37 درجة لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بماصة الأنسجة بقوة عدة مرات لتحرير خلايا مفردة وإضافة ما يكفي من وسط DMEM / F-12 ليصل الحجم الإجمالي في الأنبوب إلى 25 ملليلترا.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من Displace DNA ، واحتضانها لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، ارفع الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS. امزج الخلايا عن طريق سحب العينات وقم بتمريرها عبر مصفاة خلية 40 ميكرون إلى أنبوب سعة 50 مل.

بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS الطازج للعد. لإجراء اختبار تشكيل مستعمرة ، بعد الفرز ، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط كامل وأضف العدد المناسب من الخلايا الجذعية لسرطان الثدي إلى كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على ملليلترين من الوسط لكل أنبوب ، يسمى واحدا في 10 إلى الثانية ، أو مرتين في 10 إلى الثانية ، أو خمسة في 10 للخلايا الثانية. الماصة لأعلى ولأسفل خمس مرات لخلط معلق الخلية جيدا ووضع الخلايا في آبار فردية من ستة آبار.

قم بتدوير اللوحة برفق للحصول على توزيعات موحدة للخلايا وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا حتى تظهر المستعمرات. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من PBS لكل بئر وصمة عار الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول بنفسجي بلوري 0.05٪ لكل بئر لمدة 30 ثانية. في نهاية الحضانة ، اغسل الآبار مرتين بملليلترين من الماء لكل بئر لإزالة الصبغة الزائدة ، وعد وسجل العدد الإجمالي للمستعمرات لكل بئر عن طريق الفحص المجهري الضوئي بتكبير أربع أو 10 مرات.

لإجراء فحص الأشعة السينية ، بعد الفرز ، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط الأشعة السينية الكامل وقم بصفيحة بكثافة جلوس خمسة أضعاف 10 من الخلايا الثانية لكل سنتيمتر مربع لكل بئر في لوحة ثقافة خلية مرفقة منخفضة للغاية 96 بئر. قبل حساب عدد الأشعة السينية لكل بئر عن طريق المجهر الضوئي ، ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة خمسة إلى 10 أيام. لإعداد نموذج ثقافة ثلاثي الأبعاد ، أضف بعناية 50 ميكرولترا من مستخلص الغشاء القاعدي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر بدون فقاعات وضع اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للمحلول بالبلمرة.

أضف 100 ميكرولتر من PBS بعد 10 دقائق لتجنب جفاف طبقة الجل. في نهاية الحضانة ، قم بتعليق الخلايا المصنفة إلى خمسة إلى 50 ضعفا 10 إلى الخلايا الثالثة لكل 200 ميكرولتر من تركيز وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد واستبدل PBS في كل بئر من لوحة البئر 96 ب 200 ميكرولتر من الوسائط المحتوية على الخلايا. ثم ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 14 يوما قبل تقييم المزارع لتكوين العضوية.

تعبر خلايا سرطان الثدي البشرية التي تظهر نشاطا إنزيميا معززا ل ALDH عن مستويات عالية من CD44 ومستويات منخفضة إلى سلبية من التعبير عن CD24 ، ويمكن تصنيفها على أنها خلايا جذعية لسرطان الثدي. يمكن أن تختلف نسبة الخلايا الجذعية لسرطان الثدي بين المجموعات الكبيرة بين خطوط الخلايا أو المرضى وغالبا ما تعتمد على مرحلة المرض ، حيث يظهر سرطان الثدي الأكثر عدوانية عادة نسبة أعلى من الخلايا الجذعية لسرطان الثدي. يمكن تقييم قدرة خلية سرطان الثدي الواحدة على التجديد الذاتي وتوليد مستعمرات من 50 خلية عن طريق فحوصات تشكيل المستعمرة.

يمكن تقييم قدرة الخلايا الجذعية لسرطان الثدي على التجديد الذاتي في ظل ظروف تجريبية مستقلة عن الارتساء عن طريق فحوصات الماموسفير تسمح زراعة خلايا سرطان الثدي واستخراج الغشاء القاعدي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي بتكوين هياكل ثلاثية الأبعاد تلخص في ظروف الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام نماذج الطعم الغريب للفأر في الجسم الحي لفهم الاختلافات في النمو ، والتجديد الذاتي ، والتمايز ، و / أو قدرة بدء الورم للخلايا الجذعية لسرطان الثدي مقارنة بالخلايا الجذعية غير السرطانية لسرطان الثدي أو مجموعات الخلايا السائبة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المعزولة لسرطان الثدي في الدراسات النسخية والكينومية والتمثيل الغذائي. توفر هذه الطريقة للباحثين فرصة لاستكشاف دور الخلايا الجذعية لسرطان الثدي في بدء الورم ، والورم الخبيث ، والتكرار ، ومقاومة العلاج.