نموذج ثلاثي الأبعاد من كرويدات لدراسة الخلايا الجذعية سرطان القولون
يناير 22, 2021
يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا وقويا وقابلا للاستنساخ لتوليد وزراعة كرويات ثلاثية الأبعاد من خلايا الورم الغدي القولون Caco2. تقدم النتائج أول دليل على المفهوم لعدم ملاءمة هذا النهج لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية ، بما في ذلك الاستجابة للعلاج الكيميائي.
يمكن استخدام هذه الطريقة الجديدة من الثقافات الكروية لدراسة الورم لتحليل وجود مجموعات مختلفة من الخلايا الجذعية السرطانية ويمكن أيضا تطبيقها بشكل جيد من خلال شاشة عالية لوضع أدوية جديدة. هذا هو نظام قوي ومتكرر مثقف لتوليد عدد كبير من كرويات متجانسة الحجم. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الكرويات لدراسة الخلايا الجذعية السرطانية.
تم إعداد هذه الطريقة لدراسة بيولوجيا السرطان المزمن ولكن يمكن إعدادها بسهولة لدراسة أنواع السرطان الأخرى عن طريق تغيير ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. تأكد من مشاهدة الفقاعات في الوسط ، وعدم تحريك اللوحة كثيرا أثناء تكوين الكرويات وتوخي الحذر عند حصاد الكرويات في مصفاة. تبدأ قبل معالجة آبار لوحة بئر 24 مع 500 لتر صغير من المضادة للالتزام حل الشطف لكل بئر.
بعد بضع ثوان الطرد المركزي لوحة في الدوار يتأرجح دلو وشطف كل بئر مع 2 ملليلتر من المتوسط القاعدية الدافئة. مراقبة لوحة تحت المجهر لضمان أن الفقاعات قد أزيلت تماما من الآبار الصغيرة. إذا لم يتم ملاحظة فقاعات، شطف الآبار مرة أخرى قبل إضافة ملليلتر واحد من دافئ DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.
للحث على تشكيل كروية، انظر التركيز المطلوب من خلايا كاكو-2 في طبقة أحادية 2D في طبق 10 سم في DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. للثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو رطب. عندما يتم التوصل إلى التقاء 80٪، وغسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل علاج الثقافة مع اثنين من ملليلتر من تريبسين-EDTA لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عندما تكون الخلايا قد فصل تحييد تريبسين مع أربعة ملليلتر من DMEM كاملة. بعد العد، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاق لوحة في الحجم المناسب من DMEM الطابق السفلي مصفوفة مصفوفة متوسطة لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة لكل بئر. إضافة ملليلتر واحد من الخلايا إلى كل بئر من لوحة بئر 24 المدفوعة مسبقا، تليها إضافة ملليلتر واحد من DMEM مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة إلى كل بئر.
بعد البذر، على الفور الطرد المركزي لوحة واستخدام المجهر الخفيف للتحقق من أن الخلايا قد وزعت بالتساوي عبر الآبار الصغيرة. ثم ضع اللوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 48 ساعة دون إزعاج الخلايا. لحصاد كرويدات، في نهاية الحضانة، واستخدام ماصة المصلية ونصف من supernatant في كل بئر لطرد بلطف كرويدات من آبارها الصغيرة.
عندما تم فصل جميع كرويدات استخدام ماصة لنقل بعناية الثقافات 3D من كل بئر إلى مصفاة 37 ميكرون عكسها على رأس أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. غسل كل بئر ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من المتوسط القاعدي قبل الحرب لكل غسل لجمع أي كرويدات المتبقية وإضافة هذه كرويدات إضافية إلى مصفاة. بعد غسل الماضي تحقق من لوحة تحت المجهر للتأكد من أن جميع كرويدات قد أزيلت من الآبار الصغيرة.
ثم عكس مصفاة على أنبوب 15 ملليلتر جديدة وغسل الجزء السفلي من مصفاة مع DMEM الطازجة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة لجمع كرويدات في الأنبوب. الكرويات ترتفع من 500 خلية تثبت الزيادة الأكثر تجانسا في الحجم مع مرور الوقت. مع 500 و 600 خلية لكل كروية تحديد أن يكون العدد الأمثل للخلايا التي يمكن تحقيق نمو جيد وانخفاض التباين.
إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي يعزز نمو كروية والتجانس. في الثقافة على المدى الطويل، تظهر الخلايا كطبقات متعددة كثيفة في اليوم الثالث. في حين أن الخلايا المسطحة مرتبة في طبقات أحادية مرئية بوضوح في اليوم 10.
ومن المثير للاهتمام، يظهر التجويف داخل كرويدات من اليوم الخامس فصاعدا. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت زيادة واضحة في الخلايا النووية المتكاثرة مستضد الخلايا إيجابية في اليومين الخامس والسابع الذي ينخفض بحلول اليوم 10. والمثير للدهشة، لوحظ Caspace تنشيط 3 في عدد قليل جدا من الخلايا في اليومين الثالث والخامس فقط.
في حين لوحظت مستويات عالية من التعبير بيتا كاتينين في كل نقطة زمنية. ويتضح من إمكانات كرويدات للتمييز في Anterosites من خلال الفوسفاتاز القلوية والأسرة الناقلة سولوت 2A5 التعبير ميرنا. بالإضافة إلى ذلك ، تعبر هذه الكرويات عن علامات الخلايا الجذعية السرطانية النموذجية وتستجيب للعلاج الكيميائي المركب الذي يدار بشكل روتيني لمرضى سرطان القولون والمستقيم.
لذا تتكون كرويات من مجموعات خلايا مختلفة. ثم يمكن استخدامها بشكل جيد لتحليل الاستجابات الخاصة بالخلايا للمحفزات مثل الانكسار وفي نهاية المطاف للاستجابات الدوائية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول نظام استزراع قوي لإنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد من خلايا Caco2 لسرطان القولون الغدي. وتسمح هذه الطريقة بدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية السرطانية واستجابتها للعلاج الكيميائي.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأورام
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- يُعد فهم الخلايا الجذعية السرطانية أمراً بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة.
- تحاكي مزارع الكريات ثلاثية الأبعاد بيئات الأورام داخل الجسم الحي.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لتناسب أنواعاً مختلفة من السرطانات.
- تعتبر المتانة وقابلية التكرار ضروريتين لصحة التجارب.
الغرض من الدراسة
- تأسيس طريقة موثوقة لاستزراع الكريات (spheroids) من خلايا Caco2.
- استقصاء القدرة على تكوين الأورام ومجموعات الخلايا الجذعية السرطانية.
- تسهيل إجراء الفحص عالي الإنتاجية للأدوية الجديدة.
الطرق المستخدمة
- المعالجة المسبقة للآبار باستخدام محلول شطف مضاد للالتصاق.
- التعامل بعناية لتجنب تكون الفقاعات أثناء تشكيل الكريات.
- حصاد الكريات باستخدام مصفاة.
- مراقبة ظروف المزرعة لضمان النمو الأمثل.
النتائج الرئيسية
- توليد ناجح لكريات ذات أحجام متجانسة.
- إثبات القابلية للتطبيق في دراسة الخلايا الجذعية السرطانية.
- إمكانية الاستخدام في تطبيقات فحص العقاقير.
- القابلية للتكيف مع أنواع أخرى من السرطان عن طريق تعديل ظروف الزرع.
الاستنتاجات
- توفر هذه الطريقة أداة جديدة لأبحاث السرطان.
- إنها تعزز فهم ديناميكيات الخلايا الجذعية السرطانية.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذا النظام في التطوير العلاجي.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج نموذج الكرويات ثلاثي الأبعاد هذا الحاجة الماسة إلى أنظمة قبل سريرية تحاكي تباين الأورام والأنماط الظاهرية للخلايا الجذعية السرطانية (CSC)، مما يتيح تقييماً أكثر دقة للأهداف العلاجية والاستجابات الدوائية في أبحاث سرطان القولون والمستقيم. ومن خلال توفير منصة قابلة للتكرار للإثراء طويل الأمد للخلايا الجذعية السرطانية وتقييم الاستجابة للعلاج الكيميائي، تدعم هذه الطريقة جهود التحقق من الأهداف وتحديد المركبات الرائدة في المراحل المبكرة بثقة انتقالية محسنة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء عدم التجانس في الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) والقدرة على تكوين الأورام من خلال أنماط التكاثر التفاضلية والبنى الشبيهة بالتجويف داخل الكرويات.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق الوظيفي من الأهداف عن طريق إثراء الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) التي تعبر عن علامات محددة، مما يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية للفرضيات العلاجية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يعمل على توليد كرويات متجانسة الحجم من مدخلات خلوية محددة، مما ينشئ نظاماً معيارياً لتحليل الاستجابة الكمية للعقاقير.
- القيمة التشغيلية: يتوافق مع سير عمل الفحص عالي الإنتاجية نظراً لمتانته وقابليته للتكرار وسهولة حصاد الكرويات باستخدام الطرق المعتمدة على المصفاة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يوضح التعبير عن مؤشرات الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) والاستجابة للعلاج الكيميائي المدمج ذي الصلة سريريًا، مما يتيح النمذجة قبل السريرية لمقاومة العلاج والحساسية له.
- القيمة التشغيلية: يحافظ على الأنماط الظاهرية للخلايا الجذعية السرطانية (CSC) على مدى فترات زراعة طويلة الأمد، مما يدعم الدراسات الطولية لفعالية الأدوية وآليات تكرار الورم.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار فرضية الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة ثم التحقق قبل السريري، لا سيما في برامج أورام السرطان التي تركز على العلاجات الموجهة ضد الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وآليات المقاومة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل توضيح المسارات وتقليل المخاطر البيولوجية من خلال نمذجة منافذ الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) والاستجابات الدوائية المتباينة في سياق ثلاثي الأبعاد.
- الفحص: تتيح توحيد المقايسات من خلال تكوين كرويات متجانسة الحجم، مما يدعم الفحص الموثوق للمركبات ضد المجموعات الغنية بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC).
- التحليلات: توفر قراءات كمية عبر تعبير علامات CSC، وعلامات التكاثر (PCNA)، وعلامات الموت الخلوي المبرمج (activated Caspase-3) لمقارنة ظروف العلاج.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال نمذجة الاستجابة للعلاج الكيميائي في نظام ذي صلة بالمرض يعكس عدم التجانس في السرطان الغدي في القولون والمستقيم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابلة للتكيف مع أنواع السرطان الأخرى عن طريق تعديل ظروف الزراعة ثلاثية الأبعاد، مما يجعلها منصة قابلة لإعادة الاستخدام عبر برامج اكتشاف أدوية الأورام.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال رصد التباين الورمي المدفوع بالخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وخصائص الجذعية الوظيفية التي تغيب في النماذج ثنائية الأبعاد (2D).
- القيمة التشغيلية: توفر إمكانية التكرار والقابلية للتوسع من خلال عمليات استزراع موحدة، ومعالجة مسبقة مضادة للالتصاق، وحصاد يعتمد على المصفاة، مما يقلل من التباين في توليد الكريات الورمية.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) عبر تمكين التقييم المبكر للمركبات التي تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وآليات المقاومة، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد أولويات المركبات الواعدة بناءً على تعديل الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) وبيانات الاستجابة للعلاج الكيميائي من نموذج ذي صلة فسيولوجياً، مع مراعاة المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك معالجة الأسطح المضادة للالتصاق والتعامل الدقيق لمنع تكون الفقاعات أثناء بدء تكوين الكريات.
- يعتمد على توفر مصفوفة الغشاء القاعدي (مثل Matrigel) ومعدات زراعة الخلايا القياسية، بما في ذلك أجهزة الطرد المركزي، والمصافي (37 micron)، والمجاهر المقلوبة للمراقبة.
- يستلزم توحيد كثافة الاستزراع (500–600 cells/spheroid) وتوقيت الحضن بين الفرق لضمان التجانس وقابلية التكرار عبر التجارب.
- يتطلب التكيف مع أنواع السرطانات الأخرى تحسين تركيز الغشاء القاعدي ومدة الزراعة بناءً على حركية الالتصاق وتكوين الكريات الخاصة بكل خط خلوي.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى التعامل برفق أثناء الحصاد لتجنب تفكك الكريات، والتباين المحتمل في توقيت تكوين التجويف بين الدفعات.
