التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

تستخدم Peptoglycomics قياس الطيف الكتلي المتقدم جنبا إلى جنب مع تحليل بيانات المعلوماتية الحيوية عالية الطاقة لفحص تكوين الببتيدوغليكان بتفاصيل دقيقة. يتيح استخدام خوارزميات المعلوماتية الحيوية تحليل بيانات المواصفات الشاملة واستخراجها ومقارنتها عبر مجموعة من ملفات البيانات في وقت واحد ، مما يقلل من عبء العمل ويزيد من الدقة. إن فهم الاختلافات والتعديلات المتنوعة للببتيدوغليكان له آثار في فهم العمليات الخلوية ، بما في ذلك النمو والانقسام ، والتهرب المناعي للمضيف ، ومقاومة مضادات الميكروبات.

نوصي بإعداد وتحليل مجموعة فرعية صغيرة من العينات أولا للتعرف على البروتوكول والعمل كمشروع تجريبي لتقييم المعلمات التجريبية. نظرا لأن برنامج تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي غالبا ما يختلف في التعريفات المستخدمة عند وصف الميزات والوظائف ، فإن العرض المرئي سيساعد المستخدمين في تطبيق هذا البروتوكول عبر الأنظمة الأساسية. لاستخراج الكاكوس الببتيدوغليكان ، أعد تعليق كريات الخلايا المجمدة عند ما يقرب من واحد إلى 10 من حجم الثقافة الأصلي في 20 مللي مولار فوسفات الصوديوم عند أربع درجات مئوية قبل إضافة معلق الخلية بالتنقيط إلى غليان 8٪ SDS في 20 مللي مولار فوسفات الصوديوم إلى حجم نهائي واحد لواحد.

حافظ على غليان لطيف لمدة 30 دقيقة إلى ثلاث ساعات مع التقليب لضمان تفكك الغشاء بالكامل. يجب أن يكون الخليط الناتج واضحا تماما مع عدم وجود كتل أو لزوجة متبقية من الخلايا. عندما يبرد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، اجمع الكسوات عن طريق الطرد المركزي الفائق ، متبوعا بخمس إلى سبع غسلات في حوالي 50 مل من درجة حرارة الغرفة 20 مللي مولار فوسفات الصوديوم لكل غسلة حتى يحتوي المخزن المؤقت للغسيل على تركيز SDS يبلغ حوالي 0.001٪ كما تحدده الصبغة اللونية.

بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الكسوات في 5 إلى 10 ملليلتر من فوسفات الصوديوم بدرجة حرارة الغرفة 20 ملليمولار واستكمل العينة ب 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأميليز و DNase و RNase في 10 ملليمولار كبريتات المغنيسيوم لمدة ساعة واحدة مع التحريك أو التعويذة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، هضم التفاعل بين عشية وضحاها باستخدام 100 ميكروغرام لكل مليلتر من البروناز عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي بعد الطرد المركزي الفائق ، قم بغلي العينة لمدة ساعة واحدة في 25 مل من 2٪ SDS و 20 ملليمولار فوسفات الصوديوم في قدر بخاري.

في نهاية الحضانة ، اغسل العينة من خمس إلى سبع مرات ب 50 مل من الماء المقطر المزدوج بدرجة حرارة الغرفة كما هو موضح. عندما يصل تركيز SDS إلى حوالي 0.001٪ ، قم بتعليق الحبيبات بكمية كافية من الماء المقطر المزدوج للحصول على تعليق ساكولي وغسل الحاوية. بعد التخزين طوال الليل عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بتجميد العينة المجمدة قبل تخفيف الكسوات إلى 10 ملليغرام من الببتيدوغليكان لكل مليلتر من تركيز الماء المقطر المزدوج.

لتحليل LC-MS ، ابدأ مشروعا جديدا في برنامج الجهاز وقم بتعيين ملفات بيانات LC-MS QTOF المناسبة للحالة التجريبية ذات الاهتمام. قم بتشغيل معالج معالجة البيانات لاستخراج الميزة المتكررة دفعة وتعيين عوامل تصفية معالجة البيانات لمطابقة معلمات ظروف LC-MS والأجهزة لتحديد المجموعة بدقة والتحقق من قمم الكتلة إلى الشحن التي تمثل muropeptides الفردية. راجع النتائج في نهاية استخراج الميزات.

إذا فشل عدد كبير من الميزات في المحاذاة في مجموعة، فاضبط معلمات التصفية المتكررة لتوسيع نافذة الكشف أو تقييدها حسب الضرورة. ثم قم بتصدير البيانات كملف تبادل مركب. لتحليل المعالم الطيفية التفاضلية، ابدأ مشروعا جديدا في برنامج النظام واتبع التعليمات الخاصة باستيراد البيانات.

أثناء تحليل البيانات ، حدد الأهمية وتغيير الطي للتحليل التفاضلي وقم بتعيين بيانات خط الأساس على متوسط الكثافة عبر جميع ملفات البيانات. بمجرد اكتمال التحليل ، افحص التحليلات البيانية والإحصائية الناتجة لتحديد muropeptides التي تظهر تغيرا كبيرا في الوفرة بين الظروف التجريبية المختبرة. ضمن متصفح المشروع ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق التحليلات المختلفة وحدد خيار تصدير لحفظ تفاصيل الميزة كملف tsv.

تأكد من حفظ تحليلات متعددة للحصول على جميع البيانات ذات الصلة. ضمن برنامج التحليل التفاضلي ، ضمن تفسير النتائج ، حدد متصفح المعرف ، وأضف مكتبة من هياكل muropeptide المتوقعة ، وحدد معلمات مماثلة كما هو موضح لاستخراج الميزة لإنتاج تعليق توضيحي متوقع لكل ميزة محددة. لتأكيد التعليق التوضيحي المتوقعة يدويا لببتيد الحمض ، قارن قمم نسبة الكتلة إلى الشحنة في كروماتومات قياس الطيف الكتلي الترادفي بنسبة الكتلة إلى الشحنة المتوقعة لجميع التجزأين المحتملين لبنية موروببتيد معروفة.

استخدم محررا جزيئيا لرسم بنية موروببتيد التوربية المتوقعة باستخدام أداة تجزئة الكتلة لإظهار نسبة الكتلة إلى الشحنة لشظايا قياس الطيف الكتلي عندما يتم كسر كل رابطة إما بشكل فردي أو مجتمعة ، ثم قارن جميع التجزأين المحتملة لبنية muropeptide بكروماتوجرام قياس الطيف الكتلي الترادفي. لتأكيد التعليق التوضيحي للببتيد المخاطي ، يجب العثور على قمم نسبة الكتلة إلى الشحنة لأجزاء متعددة في مخطط كروماتوماتومتر الطيف الكتلي الترادفي مع نافذة محاذاة نسبة الكتلة إلى الشحنة القليلة جدا. لتقييم التغيرات العالمية في تعديلات muropeptide ، قم بتحرير ملف tsv الخاص ب muropeptides المتغيرة ذات الدلالة الإحصائية العالية لتضمين عمود واحد لكل تعديل muropeptide.

قم بتعبئة هذا العمود بتعيين لكل muropeptide مشروحة وتحميل ملف tsv المعدل إلى Perseus. ضمن التعليق التوضيحي على الصفوف، انقر فوق إضافة تعليقات توضيحية إلى الصفوف بشكل قاطع وإضافة ملفات بيانات إلى كل معلمة تجريبية. ثم ضمن الاختبار ، انقر فوق نموذجين من الاختبارات لإجراء اختبار T للطالب وانقر فوق 1D لإجراء تعليق توضيحي 1D.

أدت حساسية الكشف المتزايدة لآلات قياس الطيف الكتلي إلى جانب برنامج التعرف على الذروة عالي الطاقة إلى تحسين القدرة على عزل ومراقبة وتحليل تركيبات المواد للعينات المعقدة بتفاصيل دقيقة للغاية. يتم تسهيل ربط كل ذروة من الكتلة إلى الشحنة المستخرجة من بيانات قياس الطيف الكتلي مع ببتيد موروبتيد معين من خلال الإسناد المتبادل مع قاعدة بيانات لهياكل الببتيد المخاطية المعروفة والمتوقعة. يمكن مقارنة كروماتوگرام قياس الطيف الكتلي الترادفي للتجزئة لكل ميزة مستخرجة بملف تعريف التجزئة للببتيد العضوي المقترح باستخدام قاعدة البيانات.

يمكن استخدام مخططات البراكين لتسليط الضوء على muropeptides التي تظهر حجما كبيرا من الناحية الإحصائية لتغير الوفرة بين الظروف المختبرة. عند فحصها معا ، يمكن فحص العديد من muropeptides التي تمتلك نفس التعديل بحثا عن اتجاه نحو حالة تجريبية واحدة ويمكن تقييم المجموعة بأكملها من حيث الأهمية. يمكن أن يؤدي تتبع تعديل muropeptide بهذه الطريقة إلى تحديد نشاط إنزيمي معين يتأثر بالمعلمة التجريبية.

بالإضافة إلى ذلك ، قد تكشف القيم المتطرفة من هذا الاتجاه عن أنشطة إنزيمية ذات خصوصية معينة أو وظيفة بيولوجية. يفحص هذا الإجراء التغيرات الكيميائية الحيوية والاختلافات البيولوجية في البوليمرات ، وبالتالي يوفر نظرة ثاقبة للنشاط الأنزيمي الذي يعمل على PG في الجسم الحي. سيساعد فحص تكوين PG في التحقق من التفاصيل في فهم الهياكل الخلوية المعقدة التي لها آثار على العديد من العمليات الفسيولوجية الحرجة.