التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية

تسهل هذه الطريقة تحديد وتشريح الأجزاء الأنبوبية المنوية الخاصة بالمرحلة مما يسمح بدراسة خطوات محددة للغاية في تكوين المنوية. يمكن التعرف على مراحل الدورة الظهارية المنوية في الأنابيب الطازجة غير الثابتة ، وبالتالي ، يمكننا فقط تحديد مراحل الاهتمام لتحليلات المصب. يتطلب الأمر بعض الممارسة لتعلم التعرف على المراحل على أساس أنماط الإضاءة الخاصة بها ، ولكن يجب أن يضمن هذا البروتوكول نجاحك.

سيوضح الإجراء أوبيمي أولوتو ، وهو مرشح لنيل درجة الدكتوراه في مختبري. ابدأ بوضع فأر ذكر بالغ يبلغ من العمر 8 أسابيع على الأقل في وضع الاستلقاء وتطهير البطن البطني بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم مقصا معقما لعمل شق على شكل حرف V في منطقة الحوض البطنية ، واستخدم ملقطا معقما لسحب وسادة الدهون البربخية لتحديد موقع الخصيتين.

استخدم المقص لتشريح الخصيتين ، ووضع الأنسجة في طبق بتري معقم مقاس 100 ملم مع PBS أثناء حصادها. استخدم مقصا رفيع الرؤوس لقطع شق في الغلالة البيضاء ، وهي الصفيحة الليفية السميكة التي تغلف الخصيتين ، واستخدم الملقط لتمزيق الغلالة وإجبار الأنابيب على الخروج. ضع الأنابيب المنوية المفككة في طبق بتري جديد ، وأضف ما يكفي من PBS المعقم لتغطية قاع الطبق.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لفصل الأنابيب برفق دون الإضرار بالأنسجة. لتشريح الأنابيب ، قم بلصق الطبق على مرحلة مجهر تشريح وقم بتشغيل الإضاءة. استخدم ملقطا دقيقا لتحريك حزم الأنابيب بعناية للتعرف على أنماط امتصاص الضوء والتشتت في المراحل المختلفة.

بعد ذلك ، استخدم ملقطا بطرف معقوف لرفع أنبوب محل اهتمام واستخدم مقص التشريح الدقيق لقطع جزء بطول مناسب. بعد قطع مقاطع الأنابيب الخاصة بالمرحلة ، استخدم ماصة لجمع جزء مهم بحجم 10 ميكرولتر من PBS ووضع المقطع على شريحة مجهرية. اضغط بعناية على زجاج غطاء مقاس 20 × 20 ملم على النبيبات دون سحق الخلايا كثيرا وضع الشريحة على مسرح مجهر تباين الطور.

ضع ورقة ترشيح على حافة زجاج الغطاء لتسهيل انتشار الخلايا في طبقة أحادية واستخدم هدف 40 مرة للتحقق من مراحل الخلية. بمجرد أن تشكل الخلايا طبقة أحادية مستديرة من طرفي النبيبات ، اغمس الشريحة في وعاء من النيتروجين السائل لمدة 10 ثوان. استخدم مشرطا لقلب زجاج الغطاء من الخلايا وضع الشريحة على الفور في 90٪ من الإيثانول لمدة 2 إلى 5 دقائق.

بعد ذلك ، جفف في الهواء وقم بتخزين الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عدة أيام. من أجل تلطيخ المناعة الكامل للأنابيب المنوية ، استخدم ماصة لنقل الأجزاء ذات الأهمية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر من PBS المثلج البارد على الجليد. بعد السماح للأجزاء بالترسيب ، قم بإزالة PBS بعناية.

أضف 10 مل من PBS الطازج المثلج واخلطه عن طريق الانعكاس. اترك الأنابيب تستقر لبضع دقائق قبل إزالة المادة الطافية مرة أخرى كما هو موضح. عندما تتم إزالة كل المادة الطافية ، قم بتثبيت الأنابيب في 5 ملليلتر من بارافورمالدهيد لمدة خمس ساعات بمعدل 20 إلى 30 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، اترك الأنابيب تستقر لبضع دقائق قبل غسل العينة ثلاث مرات في PBS طازج عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لكل غسلة مع الدوران. بعد الغسيل الأخير، استخدم ماصة سعة 1 ملليلتر لنقل 10 إلى 20 قطعة نبيبية ثابتة إلى أنبوب سفلي دائري سعة 2 ملليلتر. عندما تستقر الأجزاء ، استبدل المادة الطافية ب 1 مليلتر من 2٪ BSA و 10٪ FBS في PBSX لمدة ساعة واحدة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة و 20 إلى 30 دورة في الدقيقة.

في نهاية حضانة الحجب ، اغسل العينات ب 1 مليلتر من PBSX. قبل وضع العلامات على الأنابيب ب 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي ، قم بتخفيفها في 1٪ BSA في PBSX لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة عند 20 إلى 30 دورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الأنابيب ثلاث مرات في PBSX كما هو موضح قبل وضع العلامات على العينات ب 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة واحدة ، محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة و 20 إلى 30 دورة في الدقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الأنابيب ثلاث مرات قبل صب الأنابيب على شريحة مجهرية بحجم صغير من المادة الطافية بعد ذلك ، استخدم أطراف تحميل الهلام لترتيب الأنابيب في شرائط خطية وتصريف المخزن المؤقت الزائد. ثم أضف 1 إلى 2 قطرات من وسط التثبيت قبل تركيب الشريحة بغطاء غطاء.

تحت الإضاءة الصافية ، تبدو المراحل من 7 إلى 8 مظلمة بشكل متجانس لأنها تحتوي على عدد كبير من المنوية المستطالة المكثفة بالكامل والتي يتم محاذاة على السطح القمي للظهارة. بعد إطلاق المنوية الناضجة في التجويف أثناء النطاف ، تبدو النبيبات شاحبة جدا في المراحل من 9 إلى 10 بسبب عدم وجود منوية ممدودة مكثفة داخل الظهارة. يتبع هذه المنطقة الباهتة منطقة البقعة الضعيفة ، والتي ينشأ مظهرها المتقطع من تنظيم المنوية المستطالة مع الكروماتين المكثف في حزم.

تصبح هذه الحزم بارزة جدا في منطقة البقعة القوية اللاحقة. تهاجر حزم المنوية نحو نوى خلايا سيرتولي التي تقع بالقرب من الصفيحة القاعدية ، والتي تنعكس كمظهر مخطط للمرحلة من 2 إلى 5 أنابيب عند المضيئة. تتشتت الحزم أخيرا في المرحلة 6 ، وتتحرك المنوية الممدودة المكثفة بالقرب من التجويف الذي يتم إطلاقه من الظهارة في المرحلة 8.

يمكن التحقق بدقة من المرحلة الدقيقة لجزء النبيبات عن طريق المجهر على تباين الطور لمستحضرات الاسكواش. يمكن استخدام التلوين المناعي لمستحضرات القرع المرحلية لدراسة التعبير عن البروتينات ذات الأهمية في الظهارة المنوية وتوطينها. عادة ما يستخدم تلطيخ الأنبوب المنوي بالكامل لدراسة أنواع الخلايا الملامسة للغشاء القاعدي للظهارة المنوية ، إما على الجانب الأنبوبي أو الخلالي.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة الخلايا أو الهياكل الموجودة في عمق الظهارة ، مثل حاجز الخصية الدموي أو الخلايا الجرثومية بعد الانتصاف. بالإضافة إلى التلوين المناعي ، يمكننا استخدام مقاطع البوق المرحلية للعديد من التحليلات النهائية الأخرى ، بما في ذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين الكيميائية الحيوية ، وقياس التدفق الخلوي ، وزراعة البوق خارج الجسم الحي. نظرا لأن هذه الطريقة تسمح بتحليل مفصل للغاية لتكوين المنوية ، فإنها توفر حقا أداة مفيدة لدراسة جميع العمليات المهمة المطلوبة لإنتاج المنوية وخصوبة الذكور.