نهجين تدفق القياسات الخلوية من NKG2D ليغاند الكشف عن السطح لتمييز الخلايا الجذعية من الخلايا الفرعية السائبة في سرطان الدم النخاعي الحاد
فبراير 21, 2021
نقدم اثنين من بروتوكولات تلطيخ مختلفة للكشف عن NKG2D ligand (NKG2DL) في عينات سرطان الدم النخاعي الحاد الأولي البشري (AML). ويستند النهج الأول على بروتين الانصهار، وقادرة على التعرف على جميع ligands المعروفة والتي يحتمل أن تكون غير معروفة حتى الآن، في حين أن البروتوكول الثاني يعتمد على إضافة الأجسام المضادة المضادة متعددة NKG2DL.
يعرض هذا البروتوكول طريقتين متميزتين للكشف عن NKG2DLs على سطح خلايا AML. توفر هذه التقنية طريقة تلطيخ سريعة وسهلة الاستخدام للكشف عن جميع NKG2DLs المعروفة وربما غير المعروفة. تسمح هذه الطريقة بفصل الخلايا الجذعية اللوكيمية عن خلايا مكافحة غسل الأموال السائبة ، مما يجعل من الممكن زيادة توصيف هذه الخلايا.
ابدأ بإذابة البيوتين وأنابيب بروتين الاندماج NKG2D في درجة حرارة الغرفة. تدور بسرعة أسفل مسحوق FC NKG2D، ثم إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعادة تشكيل مسحوق ومزيج تماما باستخدام P-1000 micropipette. إضافة 100 ميكرولتر من بروتين الانصهار NKG2DL إلى أنبوب البيوتين للحصول على تركيز نهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر، وخلط الحل جيدا مع P-100 micropipette.
لإذابة خلايا AML، قم بإزالة المبرد الذي يحتوي على مكافحة غسل الأموال الأولية من تخزين النيتروجين السائل، ووضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية. تحرك بلطف أنبوب ذهابا وإيابا في الماء، مما يسمح لمحتويات القارورة لتذوب حتى لا يكون هناك سوى الكريستال الجليد الصغيرة اليسار. نقل الخلايا المذابة فورا إلى الوسط الذي يحتوي على أنبوب وشطف القارورة باستخدام ملليلتر واحد من المتوسط.
الطرد المركزي الخلايا في 300 مرة G لمدة 10 دقائق والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه. غسل الخلايا مع خمسة ملليلتر من المتوسط RPMI تحتوي على 10٪ FCS وتكرار الطرد المركزي. إعادة إنفاق بيليه الخلية مع العازلة تلطيخ إلى تركيز النهائي من 0.5 مرات 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر.
ثم نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى ثقافة الخلية 96 جيدا U-أسفل لوحة والطرد المركزي لوحة في 300 مرة G لمدة 10 دقائق. تجاهل supernatant دون إزعاج بيليه. إعداد مزيج رئيسي من بروتين الاندماج NKG2D البيوتينية بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر لكل بئر مع تركيز NKG2D النهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر لكل بئر.
إضافة مزيج رئيسي أعدت وإعادة إنفاق الكريات الخلية مع ماصة 200 ميكرولتر. احتضان لوحة النصوص والطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة النصية. إعداد مزيج رئيسي باستخدام streptavidin PE بحيث يتم إعادة إنفاق الخلايا في حجم نهائي من 50 ميكرولتر.
إضافة المزيج الرئيسي إلى الخلايا وإعادة إنفاق الكريات مع ماصة متعددة القنوات 300 ميكرولتر. بعد الطرد المركزي لوحة والتخلص من supernatant، استخدم 300 ميكرولتر micropipette متعددة القنوات لإعادة إنفاق الكريات الخلية في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ بالإضافة إلى 7-AAD. ثم تحليل الخلايا باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.
عينات مكافحة غسل الأموال التي تم تحليلها إيجابية لCD34 و NKG2DL ، ولكن توجد أيضا مجموعات فرعية سلبية ، مع أربعة مجموعات مختلفة في المجموع. تبدأ استراتيجية التشتيت النموذجية باختيار السكان الرئيسيين للخلايا عبر FSC و SSC. يتم استبعاد Doublets والخلايا الميتة في تحليل المصب.
يتم تعديل البوابات باستخدام ضوابط FMO لضمان تحديد الخلايا الإيجابية بشكل صحيح. يتم تسليط الضوء على كثافة الفلورية للخلايا إيجابية لCD34 مقابل NKG2DL هنا. تظهر خلايا AML الموجبة ل CD34 تعبيرا سطحيا أقل عن NKG2DL ، مما يشير إلى أن تعبير NKG2DL يرتبط بعدم وجود الجذعية.
أظهرت ثلاث عينات أولية من مكافحة غسل الأموال 19.8 و49.8 و89.4٪ أحداث إيجابية لتلطيخ بروتين الانصهار مقابل 20.4 و 50.4 و 90.6٪ لتلطيخ الأجسام المضادة ل NKG2DL المجمعة. من ناحية أخرى ، أظهرت تلطيخ واحد ليغاند مجموعة من الأحداث الإيجابية تصل إلى 92 ٪ مع نسب متفاوتة على أساس ligand. عند محاولة هذا الأسلوب، من المهم جدا أن تكون سريعة عند ذوبان الخلايا AML الأساسية، لأنها هشة ويمكن أن يموت بسهولة خلال هذه الخطوة.
بعد تنفيذ هذا البروتوكول، يمكن إجراء فرز خلية استنادا إلى إشارة NKG2DL لمزيد من التحقيق في المجموعات السكانية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا البروتوكول طريقتين مختلفتين للتلوين للكشف عن ربيطات NKG2D (NKG2DLs) في عينات أولية بشرية من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). وتسمح هذه التقنيات بفصل الخلايا الجذعية اللوكيمية عن خلايا AML الكلية لإجراء المزيد من التوصيف.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- علم الأورام
خلفية علمية
- تعد ربيئات NKG2D مهمة للتعرف المناعي في السرطان.
- يفرض ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) تحديات في توصيف الخلايا.
- قد لا تتمكن الطرق الحالية من تمييز الخلايا الجذعية اللوكيمية بشكل فعال.
- يمكن لبروتوكولات الصبغ الجديدة أن تعزز قدرات الكشف.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكولات صبغ فعالة للكشف عن NKG2DL.
- تسهيل فصل الخلايا الجذعية اللوكيمية من مجموعة خلايا AML.
- تحسين توصيف عينات AML.
الطرق المستخدمة
- استخدام بروتين اندماجي للتعرف على NKG2DLs.
- تطبيق أجسام مضادة متعددة ضد NKG2DL.
- إذابة وإعادة تكوين البيوتين وبروتين NKG2D الاندماجي.
- خلط المحاليل للوصول إلى التركيزات المطلوبة لعملية الصبغ.
النتائج الرئيسية
- يكشف كلا البروتوكولين بفعالية عن مستقبلات NKG2DLs المعروفة وغير المعروفة.
- يتم تحقيق فصل الخلايا الجذعية اللوكيمية عن خلايا AML الإجمالية.
- تتميز الطرق بأنها سريعة وسهلة الاستخدام.
- من الممكن إجراء توصيف محسّن لخلايا AML.
الاستنتاجات
- تؤدي بروتوكولات الصبغ الجديدة إلى تحسين الكشف عن NKG2DLs.
- يمكن لهذه الطرق أن تساعد في فهم بيولوجيا AML.
- يمكن للأبحاث المستقبلية الاستناد إلى هذه التقنيات للحصول على رؤى علاجية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال التمييز بين الخلايا الجذعية اللوكيمية ومجموعات خلايا ابيضاض الدم النقयी الحاد (AML) الشاملة يمثل تحدياً حرجاً في التحقق من صحة الأهداف وتطوير النماذج قبل السريرية. إن القدرة على عزل المجموعات الفرعية السلبية لـ NKG2DL التي تمتلك خصائص الخلايا الجذعية تتيح الحد من المخاطر الميكانيكية للفرضيات العلاجية وتدعم الثقة التنبؤية في سير عمل الاكتشاف المبكر. ويوجه هذا النهج بشكل مباشر عملية فرز المحفظة العلاجية من خلال تحديد الأنظمة ذات الصلة بالمرض والتي تمتلك إمكانات أعلى لتكوين الأورام.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال عزل الخلايا الجذعية اللوكيمية بناءً على التعبير السطحي لـ NKG2DL.
- القيمة التشغيلية: يوفر طريقة سريعة وسهلة الاستخدام للتمييز بين المجموعات الفرعية الشبيهة بالخلايا الجذعية وخلايا AML المتمايزة.
- القيمة العلمية: يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحقق الوظيفي من خصائص الخلايا الجذعية في الأجزاء السلبية لـ NKG2DL.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد قراءات كمية بتقنية قياس التدفق الخلوي لمقارنة تعبير NKG2DL عبر مناهج صبغ محددة للرابط أو صبغ شامل للروابط.
- القيمة التشغيلية: تقديم بروتوكولات صبغ قياسية وقابلة للتكرار ومتوافقة مع تحضيرات الفرز عالي الإنتاجية.
- القيمة العلمية: تمكين تحضير أنظمة بيولوجية مُصادق عليها لعمليات فرز المركبات ودراسات ارتباط الأهداف اللاحقة.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- القيمة العلمية: تسهيل مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال ربط تثبيط NKG2DL بآليات الهروب المناعي في الخلايا الجذعية لسرطان الدم (LSCs).
- القيمة التشغيلية: دعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري عن طريق تمكين عزل الخلايا المسببة للمرض.
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال استخدام حالة NKG2DL لتصنيف المجموعات الفرعية لـ AML ذات القدرات المختلفة على تكوين الأورام.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تدمج هذه الطريقة في تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والتقييم قبل السريري، وذلك من خلال تمكين عزل مجموعات فرعية محددة ميكانيكياً.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال فصل الخلايا الجذعية المكونة للدم (LSCs) السالبة لـ NKG2DL عن خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) الكلية الموجبة لـ NKG2DL.
- الفحص: يوفر جاهزية المقايسة من خلال الكشف السطحي الكمي والمعياري المتوافق مع منصات الفحص القائمة على قياس التدفق الخلوي.
- التحليلات: يوفر قياسات كمية للمتغيرات التابعة (نسبة الأحداث الموجبة، وشدة الفلورة) مما يتيح مقارنة طرق الصبغ وترددات المجموعات الفرعية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط الاستمرارية قبل السريرية من خلال تمكين عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم (LSCs) للتحقق الوظيفي في نماذج ذات صلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس قدرة قابلة لإعادة الاستخدام لإثراء الخلايا الجذعية قابلة للتطبيق عبر عينات ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) وقابلة للتكيف مع أنواع السرطان الأخرى ذات آليات التهرب المناعي المماثلة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية في إثراء الخلايا الجذعية، وتقليل الغموض الميكانيكي في تحديد الخلايا الجذعية لسرطان الدم النخاعي الحاد (LSC).
- القيمة التشغيلية: توحيد المعايير، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في الكشف عن NKG2DL عبر عينات متعددة من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف في التحقق من الأهداف، ورفع كفاءة رأس المال من خلال تقليل المخاطر مبكراً، وتقليل المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على محفظة المشاريع: تحديد أولويات الأهداف بناءً على تعديل المخاطر، وفقاً لإمكانية إثراء الخلايا الجذعية لسرطان الدم النخاعي الحاد (LSC) والنمط الظاهري للهروب المناعي.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي، وصبغ الخلايا، والتعامل مع عينات ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) الأولية.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي، ومعدات الطرد المركزي، والكواشف بما في ذلك البيوتين، وبروتين الاندماج NKG2D، والستريبتاديفين المرتبط بـ PE، و7-AAD.
- يستلزم توحيد استراتيجيات تحديد البوابات (gating strategies)، وضوابط FMO، وإعدادات التعويض عبر الفرق لضمان اتساق النتائج.
- يتطلب مراعاة اعتبارات التكييف عند التطبيق على أنظمة نماذج مختلفة بسبب التباين في أنماط تعبير NKG2DL.
- تشمل القيود العملية هشاشة خلايا AML الأولية أثناء عملية الإذابة، مما يستلزم المعالجة السريعة للحفاظ على الحيوية.
