Name: 3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: اكتشف طريقة زراعة الأعضاء ثلاثية الأبعاد من ظهارة السوطيات المعوية المفترسة في الفئران باستخدام تقنية الكشط. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تجديد الأمعاء وعلم الخلايا الجذعية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا المنشور من قبل جائزة رقم K22 CA218462-03 من المعهد الوطني للسرطان NIH. كانت خلايا HEK293-T التي تعبر عن R-Spondin1 هدية سخية من الدكتور مايكل ب. فيرزي.

وقد حظيت جميع تجارب الماوس التي أجريت، بما في ذلك استخدام تاموكسيفين والقتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم، بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في معهد ستيفنز لعلم ال echnology.
1. الفئران
ملاحظة: جيل Smad4f/f; كاتنبlox(ex3)/+; وقد وصفت سابقا الفئران Villin-CreERT2 3. الفئران الإناث البالغات بين ثمانية إلى اثني عشر أسبوعا من agewere المستخدمة.
<ol><li>حث Smad4KO:β-cateninGOF طفرة في Smad4f/f; كاتنبlox(ex3)/+; Villin-CreERT2 مع الحقن داخل الصفاق من تاموكسيفين في زيت الذرة لمدة أربعة أيام متتالية.</li>
	<li>التضحية miceby خلع عنق الرحم بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى.</li>
	<li>رش البطن مع الإيثانول 70٪ لمنع فرو الماوس الدخول في تجويف الصفاق.</li>
	<li>افتح تجويف البطن بمقص تشريح لكشف الأمعاء. عزل الأمعاء بمساعدة مقص والمملقط. ملاحظة: ما يصاحب ذلك من فقدان Smad4 جنبا إلى جنب مع كسب طفرة وظيفة من β-catenin (Smad4KO;β-cateninGOF) في ظهارة الأمعاء تم تحقيقه عن طريق حقنSmad4و / و; كاتنبlox(ex3)/+; فئران Villin-CreERT2 كل يوم لمدة أربعة أيام متتالية بوزن جسم 0.05 غرام تاموكسيفين/كجم في زيت الذرة. يتم حصاد هذه الفئران بعد عشرة أيام من حقن تاموكسيفين الأولى لضمان وجود خلايا تعبر عن علامات مرتبطة بالخلايا الجذعية في الزغب المتمايز.</li>
</ol>2. العزلة الاثني عشر وإعداد
<ol><li>تشريح النصف القريب من الاثني عشر.</li>
	<li>تدفق الاثني عشر مع 5 مل من الجليد الباردة PBS في حقنة 10 مل لمسح المحتوى الإنارة.</li>
	<li>فتح duodenum طوليا مع مقص الزاوية ووضع شقة الاثني عشر على لوحة بيتري 15 سم على الجليد مع تجويف الاثني عشر التي تواجه المشغل.</li>
</ol>3. عزلة Villi عن طريق كشط
<ol><li>قبل البدء في كشط، ضع مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في واحدة من آبار لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا. ملء جميع الآبار مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x ووضع لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا على الجليد (الشكل 1).</li>
	<li>كشط الزغب على النحو التالي باستخدام اثنين من الشرائح الزجاجية المجهرية: واحد لعقد الاثني عشر إلى أسفل والآخر لكشط (الشكل 1B1).<ol>
<li>كشط الجانب الإنارة من الاثني عشر سطحيا إلى جيئة وذهابا مرتين لإزالة المخاط. تطبيق الضغط بحيث هذه الخطوة يزيل طبقة المخاط، ولكن ليس الزغب.</li>
		<li>كشط duodenum مرة أخرى، إلى جيئة وذهابا مرتين تطبيق نفس الضغط كما هو الحال في 3.1، وخلال ذلك يمكن أن ينظر إلى زغب جمع على الشرائح(الشكل 1B2). هذا هو الضغط الأمثل (الذي يجب تحديده تجريبيا من قبل المشغل) لتحقيق الزغب دون ربط سرداب.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام أنبوب نقل 1 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني لنقل زغب (التي يتم جمعها على الشريحة من الخطوة 3.2.2.) إلى 70 ميكرومتر شبكة مصفاة وضعت في طبق 6-جيدا. يتم جمع الزغب وبالتالي، بعد كل كشط(الشكل 1B2).</li>
	<li>غسل الزغب التي تم جمعها في مصفاة 70 ميكرومتر (من الخطوة 3.3) عن طريق نقل مصفاة (مع زغب) من خلال سلسلة من الآبار في طبق 6 آبار تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة (~ 4 مل / بئر). هذا هو لإزالة سرداب فضفاضة، إن وجدت.</li>
	<li>باستخدام أنبوب p1000، نقل تعليق زغب في برنامج تلفزيوني (~ 3 مل) من مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد 15 مل على الجليد.</li>
	<li>استخدام 0.1٪ BSA المغلفة حادة انتهت P200 تلميح pipet إلى يستنشق حجم 50 ميكرولتر من تعليق زغب على شريحة زجاجية. عد عدد الزغب في قطرة 50 ميكرولتر تحت التكبير 4x لتحديد تركيز الزغب في تعليق برنامج تلفزيوني. على سبيل المثال، إذا كان هناك 10 زغب في تعليق 50 ميكرولتر فحص، ثم تركيز الزغب هو 0.2 زغب / ميكرولتر. هذا هو أيضا الوقت المناسب لتأكيد عدم وجود سرداب المربوطة.</li>
	<li>حساب حجم تعليق الزغب المطلوبة لوحة بتركيز 0.5 زغب / ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. إضافة إضافية 100 ميكرولتر لحساب خطأ pipetting وحجم المطلوبة للفحص المجهري المطلوبة لضمان نقاء الزغب. تنبيه: الضغط المستخدم في أول كشطين ، يزيل المخاط ولكن ليس الزغب ، يجب استخدامه في الخدوش اللاحقة التي سيتم خلالها إطلاق الزغب. الحد من عدد كشط جيئة وذهابا إلى اثنين بعد أن لوحظ لأول مرة الإفراج الزغب. هذا التدبير يتجنب الإفراج عن الزغب مع سرداب المربوطة. من الضروري تقييم الزغب بشكل مجهري لضمان عدم وجود سرداب مربوطة.</li>
</ol>4. الطلاء من الزغب على مصفوفة BME-R1
<ol><li>باستخدام 0.1٪ BSA المغلفة P200 طرف الأنابيب حادة النهاية، ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق حجم الزغب (من الخطوة 3.6) المطلوبة لوحة في كثافة ~ 6 سيلي لكل بئر في 12.5 ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. استخدام طرف BSA المغلفة حادة انتهت في هذه المرحلة يضمن أن الزغب، والتي هي كبيرة جدا لطرف مدببة يستنشق دون أن يتم حظرها أو فقدت من أن تمسك إلى جانبي الطرف.</li>
	<li>تدور أسفل الزغب لمدة 2 دقيقة في 200 × ز في جهاز طرد مركزي المبردة (4 درجة مئوية) وإزالة supernatant.</li>
	<li>كرر الخطوة 4.2 لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية والمضي قدما إلى الخطوة التالية تحت غطاء محرك السيارة تدفق صفح.</li>
	<li>Resuspend بيليه الزغب بلطف في الكمية المطلوبة من BME-R1 الباردة إذابة على الجليد.</li>
	<li>باستخدام أنبوب P20، لوحة 12.5 ميكرولتر / بئر من الزغب في مصفوفة BME-R1 في 3D في لوحة U-bottom قبل الحرب 96 جيدا.</li>
	<li>احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتقويم مصفوفة BME-R1.</li>
	<li>إضافة 125 ميكرولتر / بئر من ENR قبل الحارة (عامل نمو البشرة / Noggin / R-spondin1) وسائل الإعلام: متقدمة DMEM F-12 وسائل الإعلام, تكملها 1x البنسلين: ستريبتومايسين, 10 MM HEPES, الجلوتاماكس, 50 نانوغرام/ مل EGF, 100 نانوغرام/مل نوجين, 5٪ وسائط مكيفة من خلايا HEK293-T تعبر عن R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-أسيتيل سيستين, و0.05 ملغم/مل بريموسين.</li>
	<li>احتضان الزغب المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة التي يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، وتغيير الوسائط كل يومين.</li>
	<li>تجاهل أي بئر تظهر فيه الأجهزة العضوية قبل يومين من الطلاء ، حيث أن أقرب نقطة زمنية يتوقع فيها وجود عضويات مشتقة من الزغب هي بعد يومين. ملاحظة: يتم احتساب أي زغب يحتوي على نصف أو أكثر من نصف طول الزغب ك villus واحد. على عكس الأجهزة العضوية المشتقة من سرداب، لا يتوقع الأجهزة المشتقة من الزغب في غضون 24 ساعة بعد الطلاء. يبدو أن الزغب الذي يبدأ بالعضوية يظلم ويتقلص قبل تكوين الأعضاء العضوية. وبالتالي ، ينبغي التخلص من أي آبار مع organoids النامية في غضون يوم من الطلاء لتجنب معقولية بعد أن اشتقت من التلوث سرداب معقول. المنهجية المستخدمة لإنتاج وسائل الإعلام مشروطة متاحة عند الطلب.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
<li>Roche, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+purified+epithelial+cell+population+from+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a purified epithelial cell population from human colon.</a> Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).</li>
<li>Aoki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxl1-expressing+mesenchymal+cells+constitute+the+intestinal+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).</li>
<li>Seiler, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+underlying+the+intestinal+epithelium+elicits+proliferation+of+intestinal+stem+cells+following+cytotoxic+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage.</a> Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).</li>
<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
<li>Roulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+orchestration+of+intestinal+tumorigenesis+by+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche.</a> Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+hedgehog+signals+pattern+the+intestinal+crypt-villus+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis.</a> Development. 132 (2), 279-289 (2005).</li>
<li>van Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dll1%2B+secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+Lost+Lgr5-Positive+Stem+Cells+through+Plasticity+of+Their+Enterocyte-Lineage+Daughters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters.</a> Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).</li>
<li>Baulies, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcription+Co-Repressors+MTG8+and+MTG16+Regulate+Exit+of+Intestinal+Stem+Cells+From+Their+Niche+and+Differentiation+Into+Enterocyte+vs+Secretory+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages.</a> Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).</li>
<li>Zeilstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+CD44v+isoforms+promote+intestinal+cancer+formation+in+Apc%28min%29+mice+downstream+of+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling.</a> Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).</li>
<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
<li>Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+identity+and+epithelial-mesenchymal+signaling+by+Cdx2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2.</a> Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
<li>Stringer, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx2+determines+the+fate+of+postnatal+intestinal+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm.</a> Development. 139 (3), 465-474 (2012).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.

يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة التجديد الذاتي لظهارة السيلي المتمايزة التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يمكن أن تؤدي ظهارة الأمعاء العادية إلى ظهور أعضاء من سرداب ولكن ليس مقصورة الزغب ، عندما تكون مثقفة في 3D بسبب وجود خلايا جذعية في سرداب1. وهكذا، فإن تكوين الجهاز من ظهارة السيلي المتمايزة المستزرعة في الثقافات ثلاثية الأبعاد يؤكد تكوين الخلايا الجذعية من انعكاس مصير الخلية. تقارير عن انعكاس مصير الخلية في ظهارة الأمعاء الناشئة عن الطفرات و / أو الإصابة تزداد<sup class="xr...

السراديب المعوية ولكن ليس زغب، تشكل organoids عندما مثقف في مصفوفة Matrigel أو BME-R1. هذه organoids هي هياكل التنظيم الذاتي، وغالبا ما يشار إليها باسم "الأمعاء المصغرة" بسبب وجود مختلف الأنساب المختلفة، السلف، والخلايا الجذعية الموجودة في ظهارة الأمعاء في الجسم الحي. ويعزى احتمال تشكيل organoids من سرداب إلى وجود الخلايا الجذعية1. الزغب المعوي من ناحية أخرى تتكون فقط من خلايا مختلفة، وبالتالي لا يمكن تشكيل organoids. ومع ذلك، قد تؤدي الطفرات2 أو الشروط التي تسمح dedifferentiation من ظهارة villus إلى الخلايا الجذعية في زغب2،3. يمكن تأكيد هذا التغيير المصيري الناتج عن الجذعية في ظهارة السيلي عن طريق طلاء ظهارة villus المتمايزة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز كمؤشر على النبع من الدي نوفو في ظهارة villus. وبالتالي ، فإن الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب.
وSmad4KO:β-cateninGOF الطفرة الشرطية يسبب dedifferentiation في ظهارة الأمعاء تميزت التعبير عن الانتشار وعلامات الخلايا الجذعية في الزغب, وفي نهاية المطاف تشكيل هياكل مثل سرداب في زغب يشار إليها باسم سرداب خارج الرحم تم تحديد وجود هذه الخلايا الجذعية هذه villi dedifferentiated من خلال التعبير عن علامات الخلايا الجذعية في سرداب خارج الرحم(في الجسم الحي)وقدرة الزغب متحولة لتشكيل organoids wh en مطلي ماتريجل3. الإجراء المذكور أدناه يوضح المنهجية المستخدمة لتأكيد الجذعية من ظهارة الأمعاء المتمايزة في Smad4 KO:β-cateninGOF الفئران المتحولة. كانت إحدى السمات الرئيسية لهذه المنهجية لعزل الزغب هي استخدام كشط التجويف المعوي ، بدلا منطريقةEDTA 4. على عكس طريقة إزالة EDTA ، تحتفظ عزلة الزغب عن طريق كشط غالبية mesenchyme الأساسي وتسمح بضبط ضغط الكشط لتسفر عن زغب بدون سرداب مربوطة. ضغط كشط ذاتية للمشغل، وبالتالي، يجب تحديد الضغط الأمثل لتسفر عن زغب دون سرداب المربوطة تجريبيا من قبل المشغل. الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري للزغب قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1.
يتم كشط زغب الأمعاء قبالة التجويف المعوي مع الشرائح الزجاجية ووضعها في مرشح 70 ميكرومتر وغسلها مع برنامج تلفزيوني للتخلص من الخلايا فضفاضة أو سرداب، إن وجدت، قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1. وتشدد هذه الطريقة على المعايير التالية لتجنب التلوث سرداب: أ) حصر حصاد الزغب النصف القريب من الاثني عشر حيث الزغب هي الأطول، ب) التقليل من عدد الخدوش ذات العائد الزغب، ج) غسل المرشح الذي يحتوي على الزغب من خلال سلسلة من برنامج تلفزيوني في طبق من ستة آبار، و د) مما يؤكد عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1. عزل سيلي عن طريق كشط، بدلا من EDTA chelation، يمنع فقدان كامل من mesenchyme الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة5،6،7،8، إذا لزم الأمر، لبدء organoid من ظهارة villus.

<table><tbody><tr><td>وسائط DMEM F-12 المتقدمة</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3،3-diaminobenzidine</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>96 جيدا U-bottom لوحة</td><td>فيشر Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABC مجموعة</td><td>Vector Labs</td> <td>&nbsp ؛ PK4001</td><td></td></tr><tr><td>مقص بزاوية</td><td>فيشر Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>مكمل EGF البشري المؤتلف الخالي من</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 (50X) ، ناقص فيتامين أ</td><td>جيبكو</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل البقر (BSA) مسحوق خال من البروتياز</td><td>فيشر Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 الأجسام المضادة</td><td>BioLegend</td><td>1030001</td><td></td></tr> إشارات <tr><td>خلية الأجسام المضادة Cdx2</td><td></td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>زيت الذرة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة خلية Corning 70 ميكرون</td> علوم <td>الحياة</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>مستخلص الغشاء القاعدي لعامل النمو المنخفض Cultrex ، النوع R1</td><td>R & D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>مقص تشريح</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>جلوتاماكس (100X)</td> <td>جيبكو</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293-T الخلايا التي تعبر عن RSPO-1</td><td>هدية من الدكتور مايكل فيرزي</td><td></td><td></td></tr><tr><td>هيبس (1 م)</td> <td>جيبكو</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>مرشح شبكي</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>شريحة زجاجية Micrscope</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 مكمل غذائي (100X)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 نصائح حادة</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)</td> <td>جيبكو</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>بريموسين (50 مجم / مل)</td> <td>إنفيفوجين</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS (10X)</td> <td>فيشر سيانتيفك</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>المؤتلف Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr> إشارة <tr><td>خلية</td><td>مخففة</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>تاموكسيفين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6 آبار لوحة زراعة الأنسجة</td><td>فيشر Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

3d زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

ويعزى كلونوجينيتي من organoids من ظهارة الأمعاء إلى وجود الخلايا الجذعية فيه. يتم تقسيم ظهارة الفأر المعوية الصغيرة إلى سرداب وزغب: تقتصر الخلايا الجذعية والمتكاثرة على السرداب ، في حين أن ظهارة الزغب تحتوي على خلايا مختلفة فقط. وبالتالي ، فإن سرداب الأمعاء العادية ، ولكن ليس الزغب ، يمكن أن تؤدي إلى الأجهزة العضوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد. الإجراء الموصوف هنا ينطبق فقط على ظهارة villus التي تخضع للتمايز مما يؤدي إلى الجذعية. يستخدم الأسلوب الموصوف Smad4-loss-of-function:β-catenin كسب من وظيفة (Smad4 KO:β-cateninGOF) الماوس متحولة مشروطة. الطفرة يسبب الزغب المعوية لdedifferentiate وتوليد الخلايا الجذعية في الزغب. يتم كشط الزغب المعوي الذي يخضع للتمايز من الأمعاء باستخدام الشرائح الزجاجية ، ووضعها في مصفاة 70 ميكرومتر وغسلها عدة مرات لتصفية أي خلايا فضفاضة أو سرداب قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1 لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز. تم استخدام معيارين رئيسيين لضمان تطوير الأجهزة العضوية الناتجة من مقصورة villus المتمايزة وليس من السراديب: 1) تقييم الزغب المعزول بشكل مجهري لضمان عدم وجود أي سرداب مربوطة ، قبل وبعد الطلاء في المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، و 2) مراقبة المسار الزمني لتطور الجهازية من villi. بدء العضوية من الزغب يحدث بعد يومين إلى خمسة أيام فقط من الطلاء ويبدو على شكل غير منتظم، في حين أن organoids المستمدة من سرداب من ظهارة الأمعاء نفسها واضحة في غضون ستة عشر ساعة من الطلاء وتظهر كروية. الحد من هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أن عدد organoids شكلت، والوقت اللازم لبدء organoid من الزغب تختلف تبعا لدرجة dedifferentiation. وبالتالي ، اعتمادا على خصوصية الطفرة أو الإهانة التي تسبب التمايز ، يجب تحديد المرحلة المثلى التي يمكن فيها حصاد الزغب لتقصي إمكانات تشكيل الأعضاء الخاصة بهم ، تجريبيا.

العامل الحاسم لنجاح الإجراء هو منع تلوث سرداب. يتم ضمان تطور الجهاز من الزغب (وليس من أي سرداب ملوثة) من خلال تأكيد أربعة معايير رئيسية: 1) ضمان نقاء الزغب المحصود عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد طلاء الزغب في BME-R1 ، 2) طلاء عدد محدود من الزغب لكل بئر للسماح بتصور جميع الزغب المطلي بشكل فردي ، 3) على زراعة تطوير الجهاز يوميا؛ صور من الدورة الزمنية تظهر تطور organoid من الزغب(الشكل 3)،و 4) onitoring الحركية والمظهر المورفولوجي من organoids الشروع من الزغب؛ الأجهزة التي تبدأ من الزغب تظهر على...

يصف الإجراء عزل الزغب من ظهارة الفأر المعوية التي تخضع للتمايز لتحديد إمكانات تكوين الأعضاء.

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة تشكيل الجهازية لظهارة السيلي التخلص من التمييز التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يتم تنفيذ جمع الزغب عن طريق كشط بدلا من طريقة EDTA chelation منع الخسارة الكاملة للميسينشيم الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة إذا لزم الأمر لبدء organoid. تنطبق هذه الطريقة في الأنسجة الظهارية حيث يتم تحديد المقصورات التكاثرية والمتمايزة جسديا وتعبر الخلايا المزيلة للتمييز عن علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي.بعض العوامل في هذا البروتوكول تحتاج إلى تحديد تجريبي، بما في ذلك المرحلة المثلى لحصاد الزغب والضغط الأمثل للتخلص من الزغب، الأمر الذي سيستغرق وقتا وممارسة. حث Smad4 بالضربة القاضية والحصول على بيتا كاتينين من طفرة وظيفة في الفئران المتحولة مع الحقن داخل الصفاق من تاموكسيفين وزيت الذرة لمدة أربعة أيام متتالية. بعد القتل الرحيم للفأر، رش البطن مع 70٪ الإيثانول لمنع فرو الماوس من الدخول في تجويف الصفاق.افتح تجويف البطن بمقص تشريح لكشف الأمعاء وعزل الأمعاء باستخدام مقص ومملقط. تشريح النصف القريب من الاثني عشر، ثم طرد الاثني عشر مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS في حقنة 10 ملليلتر لمسح المحتوى الإنارة. فتح duodenum طوليا مع مقص الزاوية ووضع شقة الاثني عشر على طبق بيتري 15 سنتيمترا على الجليد مع تجويف الاثني عشر التي تواجه المشغل.قبل البدء في كشط، ضع مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في واحدة من آبار لوحة زراعة الأنسجة من ستة آبار. ملء جميع الآبار مع أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1X ووضع لوحة على الجليد. كشط الزغب باستخدام اثنين من الشرائح الزجاجية المجهرية، واحدة لعقد الاثني عشر إلى أسفل والآخر لكشط.كشط الجانب الإنارة من الاثني عشر سطحيا مرتين لإزالة المخاط دون إزالة الزغب، ثم كشط الاثني عشر مرتين أخريين لجمع الزغب على الشرائح دون ربط سرداب. استخدام ماصة نقل ملليلتر واحد يحتوي على برنامج تلفزيوني لنقل الزغب إلى مصفاة شبكة 70 ميكرومتر في طبق من ستة آبار. جمع الزغب بعد كل كشط.لإزالة سرداب فضفاضة، وغسل الزغب التي تم جمعها مع مصفاة 70 ميكرومتر عن طريق نقل مصفاة من خلال سلسلة من الآبار في طبق من ستة آبار تحتوي على أربعة ملليلتر من الجليد البارد PBS لكل بئر. باستخدام ماصة P1000، نقل تعليق الزغب في حوالي ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني من مصفاة 70 ميكرومتر إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر على الجليد. استخدام 0.1٪ BSA المغلفة حادة انتهت P200 تلميح ماصة لنقل حجم 50 ميكرولتر من تعليق زغب على شريحة زجاجية.عد عدد الزغب في قطرة 50 ميكرولتر تحت التكبير 4X لتحديد تركيز الزغب في تعليق برنامج تلفزيوني وتأكيد عدم وجود سرداب مربوطة. للوحة الزغب، استخدم 0.1٪ BSA المغلفة P200 طرف ماصة حادة النهاية لنقل الزغب إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق لكثافة الطلاء من ستة زغب لكل بئر في 12.5 ميكرولتر من مصفوفة BME-R1. تدور أسفل الزغب لمدة دقيقتين في 200 مرة G في أربع درجات مئوية.إزالة supernatant وتكرار الطرد المركزي لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، resuspend بيليه الزغب بلطف في الكمية المطلوبة من BME-R1 الباردة إذابة على الجليد. باستخدام ماصة P20، لوحة 12.5 ميكرولتر من الزغب في مصفوفة BME-R1 لكل بئر من لوحة U-bottomed جيدا 96 جيدا قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية.احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح بتقويم مصفوفة BME-R1. إضافة إلى كل بئر، إضافة 125 ميكرولتر من وسائل الإعلام ENR قبل الحارة تكمل كما هو موضح في المخطوطة النصية. احتضان الزغب المطلي في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين.تجاهل أي بئر تظهر فيه العضيات قبل يومين. هناك فرق في مظهر الأجهزة الناشئة من السراديب مقابل ظهارة السيلي غير المتمايزة من نفس أمعاء الماوس. تظهر الأجهزة العضوية المشتقة من سرداب بين عشية وضحاها كهياكل كروية ذات حدود محددة جيدا.تم فحص الحركية والمظهر المورفولوجي للأعضاء التي بدأت من الزغب ، والتي تظهر على شكل غير منتظم في البداية و تستغرق يومين إلى خمسة أيام قبل أن يمكن رؤيتها تحت المجهر. يظهر بدء العضوية من اثنين من زغب مختلفة. يبدو الزغب مع إمكانية تشكيل الجهاز كثيفة، وربما يرجع ذلك إلى الاحتفاظ mesenchyme الكامنة.بدء Organoid من الفيلات هو واضح في اليوم الثاني من واحدة من الزغب. بينما في الفيلات الأخرى، يظهر الجهاز في اليوم الرابع. من المهم اتخاذ الخطوات المناسبة لتجنب التلوث سرداب عند حصاد الزغب وزراعة الأجهزة الناتجة.لوحظت اختلافات فينوتبيك بين الأجهزة الناشئة من السراديب والسخافات من نفس المتحولة بعد هذا الإجراء ، لذلك يمكن إجراء المزيد من التجارب للبحث عن الاختلافات الجزيئية بين الاثنين. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الاختلافات بين الأجهزة الناشئة عن السراديب الذاتية مقابل السراديب خارج الرحم الناشئة عن إزالة التمايز، وبالتالي يمكن معالجة الآثار المترتبة على إزالة التمايز.

3d-culturing-organoids-from-intestinal-villi-epithelium-undergoing

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نصف طريقة لإنشاء الأمعاء البشرية من الخبايا المعوية الدقيقة والقولون من خبايا القولون التي تم جمعها من كل من الأنسجة الجراحية والخزعات. في هذه المقالة المنهجية ، نقدم طرائق الاستزراع الضرورية للنمو الناجح والحفاظ على الأمعاء والقولون البشرية.

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

نقدم هنا، بروتوكولا للثقافة البشرية انتيرويد أو مونولاييرس كولونويد التي لها وظيفة الحاجز سليمة لدراسة التفاعلات الظهارية الحجمية المضيف على المستوى الخلوي والكيمياء الحيوية.

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

يسمح هذا البروتوكول بتمايز الخلايا البشرية متعددة القدرات إلى عضويات معوية. يحاكي البروتوكول التطور البشري الطبيعي عن طريق تمييز الخلايا إلى مجموعة من الأديم الباطن النهائي والأديم الباطن الخلفي ثم ظهارة الأمعاء. هذا يجعل البروتوكول مناسبا لدراسة كل من نمو الأمعاء وكذلك تطبيقات نمذجة الأمراض.

توليد عضويات معوية مشتقة من hiPSC لتطبيقات النمذجة التنموية والمرضية

هنا ، نصف إعداد الطبقات الأحادية الظهارية المعوية المشتقة من الأعضاء البشرية لدراسة وظيفة الحاجز المعوي والنفاذية والنقل. نظرا لأن المواد العضوية تمثل استجابة الأنسجة الظهارية الأصلية للمحفزات الخارجية ، فإن هذه النماذج تجمع بين مزايا قابلية تمدد خطوط الخلايا وأهمية الأنسجة الأولية وتعقيدها.

الطبقة الظهارية الأحادية المشتقة من المواد العضوية: نموذج ذو صلة سريريا في المختبر لوظيفة الحاجز المعوي

هنا نقدم اثنين من البروتوكولات التي تسمح النمذجة من التفاعلات المعوية apical محددة. تسهل الطبقات الأحادية المعوية المشتقة من الجهاز وثقافات واجهة الهواء السائل (ALI) توليد الظهارة المتباينة بشكل جيد والتي يمكن الوصول إليها من كلا الجانبين الإنارة والباسولاتيري ، في حين أن الأجهزة المعوية المقلوبة القطبية تعرض جانبها العضي وقابلة للمقاسات عالية الإنتاجية.

أساليب الثقافة لدراسة التفاعلات Apical محددة باستخدام نماذج الجهاز المعوي

يصف البروتوكول الحالي إنشاء نظام عضوي قولوني للفئران لدراسة نشاط وعمل الخلايا الجذعية القولونية في نموذج خروج المغلوب claudin-7.

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

هنا ، وصفنا بروتوكولا لثقافة الخنازير المعوية 3D organoids من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. نحن أيضا وصف طريقة لإنشاء أحادي الخلية المستمدة من المواد العضوية 3D ، مما يسمح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية.

ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

وصفنا بروتوكولا لعزل خبايا الفئران المعوية الصغيرة والثقافة العضوية المعوية 3D من الخبايا. بالإضافة إلى ذلك ، وصفنا طريقة لتوليد المواد العضوية من خلية جذعية معوية واحدة في حالة عدم وجود مكانة خلوية شبه ظهارية.

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية للفئران واستخدامها في العديد من التطبيقات النهائية. غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا قبل السريري ، ويملأ النظام العضوي المعوي القوي الحاجة إلى نظام في المختبر لمرافقة الدراسات في الجسم الحي .

توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران

يجمع البروتوكول بين تقنية العضوية المعوية البشرية والتحليل النسخي أحادي الخلية لتوفير نظرة ثاقبة مهمة في بيولوجيا الأمعاء غير المستكشفة سابقا.

استخدام الكائنات العضوية المعوية البشرية لفهم ظهارة الأمعاء الدقيقة على مستوى النسخ أحادي الخلية

تحدد هذه الدراسة بروتوكولا لتوليد طبقات أحادية ثنائية الأبعاد من عضيات الخنازير المشتقة من الأمعاء الدقيقة والغليظة. يتميز نمو هذه الطبقات الأحادية بزيادة قيم TEER ، مما يشير إلى سلامة ظهارية قوية. بالإضافة إلى ذلك, هذه أحادية الطبقات يعرض الاستجابات الإفرازية الفسيولوجية في تجارب غرفة أوسينج بعد تطبيق فورسكولين.

عضيات معوية خنزير ثنائية الأبعاد تعكس الخصائص الفسيولوجية للأمعاء الأصلية

اكتشف طريقة زراعة الأعضاء ثلاثية الأبعاد من ظهارة السوطيات المعوية المفترسة في الفئران باستخدام تقنية الكشط. تساعد هذه الطريقة الباحثين على دراسة تجديد الأمعاء وعلم الخلايا الجذعية.

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

استكشف المزيد من الفيديوهات