Name: بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: اكتشف بروتوكولاً محسّناً لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران بكفاءة زمنية وتقليل الجهد، باستخدام مضخة تمعّجية ووسط كولاجيناز. يُحسّن هذا الأسلوب نقاوة الخلايا ووظائفها الأيضية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 5R01HD095512-02 إلى S.W.).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران (8 أسابيع) في هذه الدراسة.
1. التحضير:
<ol><li>امزج ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) مع محلول FBS بنسبة 10٪ ومحلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ لجعل الثقافة متوسطة.</li>
	<li>قم بتصفية 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل (على سبيل المثال ، Liver Digest Medium) من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الجسيمات.</li>
	<li>دافئ 50 مل من H 2 O مزدوج المقطر (ddH2O) ، و 35 ملمن وسط التروية (على سبيل المثال ، وسط تروية الكبد) (أو 50 مل في المرة الأولى باستخدام هذا البروتوكول) ، و 25 مل من وسط الكولاجيناز المصفى في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، امزج 2 مل من 10x HBSS و 18 مل من Percoll في أنبوب 50 مل لصنع 20 مل 1x Percoll-HBSS والحفاظ على الجليد أو 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن الاحتفاظ ب 1x Percoll-HBSS عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.</li>
	<li>داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، صب 30 مل من وسط الغسيل (على سبيل المثال، وسط غسيل خلايا الكبد) في طبق بتري نظيف، واحتفظ به على الثلج.</li>
	<li>اغمر أنبوب الضخ في ماء حمام مائي 45 درجة مئوية. تكون النتائج أكثر موثوقية إذا كانت درجة حرارة الغرفة عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>تحضير 2 مل من مخدر 1x عن طريق خلط 225 ميكرولتر من الكيتامين HCL ، 93.75 ميكرولتر من Xylazine ، و 1681 ميكرولتر من 1x PBS.</li>
	<li>تخدير فأر واحد باستخدام طريقة معتمدة. هنا تم حقن الفأر داخل الصفاق مع 150 ميكرولتر من 1x التخدير. قم بإجراء اختبارات فقدان ردود الفعل مثل رد الفعل على قرص إصبع القدم لضمان التخدير الكامل.</li>
	<li>قم بتثبيت الماوس على ظهره على وسادة التشريح بواسطة أربعة أطراف ، إما عن طريق تثبيت أو استخدام شريط مقاوم للماء أو طرق أخرى معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسة (أو ما يعادلها).</li>
	<li>تحضير ملقط ومقص معقم للتشريح. لتجنب التلوث المحتمل ، قم بإجراء جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة المعقم.</li>
</ol>2. الإجراء:
<ol><li>باستخدام مضخة تمعجية ، ابدأ في ضخ ddH2O المحموم بسرعة 4 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط تروية مسخن.</li>
	<li>قم بتطهير بطن الفأر المخدر بنسبة 70٪ EtOH وقم بفتحه بمقص لفضح الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي (IVC).</li>
	<li>أوقف المضخة التمعجية. أدخل قسطرة 24 جم (على سبيل المثال، قسطرة وريدية مغلقة، 24 جم، 0.75 بوصة) في IVC. ابدأ في الضخ وقطع الوريد البابي مفتوحا.</li>
	<li>استمر في الضخ حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا (حوالي 3-5 دقائق). اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. احرص على عدم السماح لفقاعات الهواء بالدخول إلى IVC. ملاحظة: هذه الخطوة هي طرد أكبر قدر ممكن من الدم من الكبد.</li>
	<li>قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط الكولاجيناز المنفصل. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل أثناء القيام بالخطوة 2.6.</li>
	<li>اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون الفقدان الكامل للدم قاتلا للماوس. يمكن تأكيد وفاة الفأر من خلال نقص ضربات القلب بعد التجربة. تخلص من الذبيحة وفقا لسياسات المنشأة.</li>
	<li>اعزل الكبد بالكامل بدون مرارة إلى وسط الغسيل 30 مل في طبق بتري على الثلج.</li>
	<li>قم بتمزيقه إلى قطع باستخدام ملقط لإطلاق خلايا الكبد الأولية في محلول. هذه الخطوة من شأنها أن تحول وسط الغسيل إلى محلول غائم مليء بخلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة.</li>
	<li>قم بتصفية المحلول الغائم في الخطوة 2.8 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى 20 مل 1x Percoll-HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. اخلط عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. اغسل الكريات ببرودة 30 مل من وسط الغسيل.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في 25 مل من وسط المزرعة (أو الأحجام الأخرى المناسبة) داخل غطاء زراعة الأنسجة.</li>
	<li>عد رقم الخلية ولوحة الخلايا على لوحات الثقافة المطلوبة وفقا للتصميم التجريبي. ملاحظة: عادة ما تكون خلايا الكبد الأولية المعزولة بشكل صحيح من فأر واحد عمره 8 أسابيع كافية ليتم طلاؤها على أربعة ألواح من 6 آبار أو أربع لوحات من 12 بئرا.</li>
</ol>

<ol><li>Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+metabolism+from+a+liver-centric+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective.</a> Experimental and Molecular Medicine. 48, 218(2016).</li>
<li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes%3A+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cell+polyploidization%3A+a+pivotal+role+for+binuclear+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> Elife. 4, 11214(2015).</li>
<li>Bruening, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+enters+liver+cells+using+the+CD81+receptor+complex+proteins+calpain-5+and+CBLB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB.</a> PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111(2018).</li>
<li>Silvie, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+CD81+is+required+for+Plasmodium+falciparum+and+Plasmodium+yoelii+sporozoite+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity.</a> Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).</li>
<li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+as+immunological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes as immunological agents.</a> Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).</li>
<li>Liu, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TR4+orphan+nuclear+receptor+reduces+phosphoenolpyruvate+carboxykinase-mediated+gluconeogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis.</a> Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotrope+androgen+receptor+mediates+pituitary+responsiveness+to+hormones+and+androgen-induced+subfertility%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility.</a> JCI Insight. 5 (17), 127817(2019).</li>
<li>Santos, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+transthyretin+neuroprotection+in+a+mouse+model+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).</li>
<li>Pinhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Fas+and+FasL+is+associated+with+infectious+complications+and+severity+of+experimental+severe+acute+pancreatitis+by+promoting+apoptosis+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes.</a> Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).</li>
<li>Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mannose+and+asialoglycoprotein+receptor+expression+determines+glycoprotein+hormone+half-life+at+critical+points+in+the+reproductive+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).</li>
<li>Tanowitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+mediates+productive+uptake+of+N-acetylgalactosamine-conjugated+and+unconjugated+phosphorothioate+antisense+oligonucleotides+into+liver+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).</li>
<li>Manczak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralization+of+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+decreases+amyloid+beta+1-42+and+suppresses+microglial+activity+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK1-dependent+transphosphorylation+of+JAK2+limits+the+antifibrotic+effects+of+selective+JAK2+inhibitors+on+long-term+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+angiogenesis+markers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of angiogenesis markers.</a> American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-147%2C+a+microRNA+that+is+induced+upon+Toll-like+receptor+stimulation%2C+regulates+murine+macrophage+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+minimally+humanized+CD81+and+occludin+genes+support+Hepatitis+C+virus+uptake+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo.</a> Journal of Virology. 91 (4), 01799(2017).</li>
<li>Renshaw, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+impaired+Toll-like+receptor+expression+and+function+in+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging.</a> Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Salem, E. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+hepatocytes+for+nascent+protein+synthesis+analysis+by+non-radioactive+l-azidohomoalanine+labeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323(2018).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
<li>Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+3D+collagen+sandwich+culture+of+primary+mouse+hepatocytes+to+study+the+role+of+cytoskeleton+in+bile+canalicular+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507(2019).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+Journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar Journal. 6, 169(2007).</li>
<li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation%3A+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).</li>
<li>Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf</a> (2021).</li>
<li>Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+cancer+cell+of+origin%2C+molecular+class%2C+and+effects+on+patient+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis.</a> Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).</li>
<li>Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+location+and+distribution+of+hepatic+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Differential location and distribution of hepatic immune cells.</a> Cells. 6 (4), 48(2017).</li>
<li>Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes%3A+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).</li>
<li>Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History%2C+heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).</li>
<li>Poisson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+sinusoidal+endothelial+cells%3A+Physiology+and+role+in+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases.</a> Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).</li>
<li>Peter, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD95+receptor%3A+apoptosis+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD95 receptor: apoptosis revisited.</a> Cell. 129 (3), 447-450 (2007).</li>
<li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li>
<li>Willoughby, J. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+GalNAc-siRNA+conjugate+activity+in+pre-clinical+animal+models+with+reduced+asialoglycoprotein+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression.</a> Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).</li>
<li>Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer+cells+protect+liver+sinusoidal+endothelial+cells+from+Fas-dependent+apoptosis+in+sepsis+by+down-regulating+gp130%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130.</a> American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تم تطوير العديد من بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية. كما تم الحفاظ عليها على النحو الأمثل وتكييفها بناء على الاحتياجات المختلفة (الجدول 1). تتكون بروتوكولات العزل عموما من جزأين: التروية (بما في ذلك هضم الإنزيم) والتنقية.
 يمكن إجراء التروية مع الكبد بأكمله في الجسم الحي 2،20،21،22،23 أو مع فصوص الكبد تشريح24</...

الكبد بمثابة واحد من أهم الأعضاء في الجسم الفقاري بسبب الدور الحيوي الذي يلعبه في العديد من الوظائف الداعمة للحياة مثل هضم الطعام والدورة الدموية وإزالة السموم. استخدام خلايا الكبد الأولية للفئران في ثقافة المختبر تحظى بشعبية متزايدة في دراسات استقلاب الكربوهيدرات وسرطان الكبد. لذلك ، من المهم تطوير طريقة ملائمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية الفطرية. نظرا لوظيفته كمركز لاستقلاب الجلوكوز ، فإن الكبد هو أيضا مركز لإنتاج الجلوكوز وتخزينه1. التجارب مع خلايا الكبد الأولية في المختبر أمر لا بد منه لمعظم دراسات استقلاب الجلوكوز. لذلك ، لسنوات ، طورت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.
الإجراء العام لعزل خلايا الكبد لدى الفئران هو أولا طرد الدم في الكبد بسائل متساوي السمو مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ثم استخدام محلول يحتوي على الكولاجيناز لفصل خلايا الكبد. تشترك هذه البروتوكولات في إجراء عام ولكنها تختلف في الكواشف والخطوات القائمة على الاحتياجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن إعداد الكواشف المطلوبة وتنفيذ خطوات العزل يستغرق وقتا. ولدى وضع هذا البروتوكول، وضعت الكفاءة كأولوية، مع جعل جميع الكواشف جاهزة للاستخدام ومتاحة من السوق، وبأقل خطوات ممكنة. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة سريعة وفعالة في العمل لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفأر ، دون تعريض نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة وقدرتها على البقاء للخطر.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12 بئر لوحة</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>طلاء غير مطلوب</td></tr><tr><td>6 آبار طلاء</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>غير مطلوب</td></tr><tr><td>مضاد</td><td>للخلايا</td> AKT <td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>محلول مضاد للبيبات مضاد للفطريات (100x) ، مستقر</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>المضادة ل FOXO1</td><td>خلية الإشارات</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>المضادة ل GAPDH</td><td>خلية الإشارات</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>المضادة ل p-AKT (S473)</td> <td>إشارات الخلية</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>المضادة ل PEPCK</td><td>سانتا كروز</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>المضادة ل p-FOXO1 (S256)</td> خلية <td>الإشارات</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>مصفاة الخلية ، 70 ومايكرو. m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>قسطرة IV مغلقة ، 24 مقياس 0.75 بوصة</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ، بدون جلوكوز ، بدون جلوتامين ، بدون فينول أحمر</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom Glucose Assay Kit</td> أنظمة <td>الفحص الحيوي</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>الماعز المضاد للأرانب IgG الجسم المضاد الثانوي</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr> خلايا <tr><td>الكبد غسل متوسط</td><td>جيبكو</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr>إشارات <td>خلية</td><td>IBMX</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>الأنسولين</td><td>ليلي</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>الكيتامين هيدروكلوريك (100 مجم / مل)</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>Aliquot داخل غطاء مزرعة الأنسجة إلى 25 مل لكل في أنبوب 50 مل ، واحتفظ به في -20 درجة ؛ C فريزر</td></tr><tr><td>نضح الكبد متوسط</td><td>جيبكو</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>القلم Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>مضخة التمعجية</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>قادرة على الضخ بسرعة 4 مل / دقيقة</td></tr><tr><td>طبق بتري</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr> جهاز <tr><td>طرد</td> <td>مركزي مبردSorvall</td><td>Legend RT</td><td>قادرة على الطرد المركزي 50 مل أنبوب عند 4 درجات ؛ C</td></tr><tr><td>الصوديوم L-Lactate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr>فلتر حقنة <td>11360070</td><td></td><td>الصوديوم بيروفات</td><td>جيبكو</td></tr><tr><td>، PVDF 0.45 & micro ؛ م 30 مم</td> قطر حقنة <td></td><td>CELLTREAT 229745</td><td></td></tr><tr><td>، 0.5 مل</td> حقنة <td>329461</td><td></td><td>بيكتون ديكنسون</td></tr><tr><td>، 60 مل</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution ، 0.4٪</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tube ، 15 مل</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tube ، 50 مل</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Water خزان الحمام</td><td>كورنينج</td><td>CLS6783</td><td>أو أي خزان حمام مائي قادر على تسخين ما يصل إلى 45 درجة ؛ سي</td></tr><tr><td>ويليام S E متوسط (مكمل GlutaMAX)</td><td>جيبكو</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>زيلوزين (100 مجم / مل)</td><td>فيتون أناسيد لوس أنجلوس</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في أبحاث الكبد في المختبر ، خاصة في دراسات استقلاب الجلوكوز. تم تكييف تقنية أساسية بناء على احتياجات مختلفة ، مثل الوقت والعمالة والتكلفة واستخدام خلايا الكبد الأولية ، مما أدى إلى بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الخطوات العديدة ومستحضرات الكواشف التي تستغرق وقتا طويلا في عزل خلايا الكبد الأولية هي عيوب رئيسية للكفاءة. بعد مقارنة بروتوكولات مختلفة لإيجابياتها وسلبياتها ، تم الجمع بين مزايا كل منها ، وتم صياغة بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية بسرعة وكفاءة. في غضون 35 دقيقة فقط ، يمكن لهذا البروتوكول أن ينتج الكثير ، إن لم يكن أكثر ، من خلايا الكبد الأولية الصحية مثل البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، أثبتت تجارب استقلاب الجلوكوز التي أجريت باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة فائدة هذا البروتوكول في دراسات استقلاب الكبد في المختبر . كما قمنا بمراجعة وتحليل أهمية وغرض كل خطوة في هذه الدراسة على نطاق واسع حتى يتمكن الباحثون المستقبليون من تحسين هذا البروتوكول بناء على الاحتياجات.

من أجل اختبار الكفاءة ، تم إجراء بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية الحالية على الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اختبار تعلق ونقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة. يستخدم عزل خلايا الكبد الأولية لمجموعة واسعة من التجارب على فسيولوجيا الكبد ، مثل تأثيرات الأدوية الكبدية واستقلاب الجلوكوز ، ونشاط المؤشرات الحيوية الصيدلانية2 ، وحساسية الأنسولين ، وإنتاج الجلوكوز. لذلك ، تم اختبار أنشطة خلايا الكبد الأولية المعزولة بهذا البروتوكول في التجارب التالية.
لم ي...

خلايا الكبد الأولية هي أداة قيمة لدراسة استجابة الكبد والتمثيل الغذائي في المختبر. باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

خلايا الكبد الأولية للفئران مهمة في دراسات الكبد. خاصة بالنسبة لاستقلاب الجلوكوز ، واختبار الأدوية الكبدية. من ناحية الوقت ، يمكن أن تستغرق عملية العزل وقتا طويلا وتكلف الطاقة.يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر. إنه الوقت وسهولة العمل. يتطلب خطوات قليلة جدا مع جميع المناطق المتاحة تجاريا.ابدأ باستخدام المضخة التمعجية لبدء ضخ الماء المقطر المزدوج الدافئ بسرعة 4 مل في الدقيقة ، لمدة خمس دقائق. ثم قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط التروية الساخن. مراقبة فقاعة الهواء بين الماء ووسط التروية.سوف يساعد على تتبع تدفق وسط التروية من خلال النظام. بعد ذلك تطهير البطن من مخدر ثمانية أسابيع C57 أسود 6J أنثى الفأر مع 70 ٪ من الإيثانول. وباستخدام مقص ، قم بقطع البطن لكشف الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي.ثم أوقف المضخة التمعجية. بعد التأكد من أن أنبوب الضخ يحتوي على وسط التروية وليس الماء. أدخل قسطرة قياس 24 في الوريد الأجوف السفلي.قم بتشغيل المضخة مرة أخرى وقم بفتح الوريد البابي. أثناء ضخ وسط التروية ، اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ لمدة ثلاث إلى خمس دقائق تقريبا أو حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا.بعد ذلك قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط توزيع الكولاجيناز. واضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط إزالة الكولاجيناز.بعد ذلك عزل الكبد كله دون المرارة. ووضعها في 30 مل من وسط الغسيل في طبق بتري على الثلج. باستخدام ملقط تمزيق الكبد إلى قطع لإطلاق خلايا الكبد الأولية في المحلول.في هذه المرحلة ، يتحول وسط الغسيل إلى محلول غائم يحتوي على خلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة. قم بتصفية هذا الحل الغائم من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرون ، إلى 20 مل من 1X لكل مكالمة HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. وامزج المحلول عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.التالي الطرد المركزي الحل. ثم في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. واغسل الكريات ب 30 مل من وسط الغسيل البارد.بيليه الخلايا مرة أخرى مع الطرد المركزي. قم بإزالة السوبرناتانت ، وأعد تعليق الكريات في 25 مل من وسط الثقافة. عد الخلايا وطبقها على لوحات الثقافة المطلوبة.وفقا للتصميم التجريبي. بعد الطلاء ، تم ربط خلايا الكبد الأولية المعزولة بقوة لمدة ساعة واحدة وتوسعت بالكامل بعد 12 ساعة. في خلايا الكبد المعزولة ، زادت مستويات mRNA من علامات خلايا الكبد ، مثل transthyretin و CD95 و ASGR1 و ASGR2 بشكل كبير مقارنة بالكبد بأكمله.على النقيض من ذلك ، كان وجود الخلايا المناعية والخلايا النجمية والخلايا البطانية أقل. كما يتضح من الانخفاض الحاد في CD45 ، الكولاجين من النوع 1 ألفا 1 ، والخلية البطانية 2 كيناز 2 مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال. مما يشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يقلل بشكل كبير من التداخل من الخلايا الكبدية الأخرى.بعد طلاء مستويات ASGR1 و ASGR2 انخفضت مع مرور الوقت ، ولكن تبقى قابلة للمقارنة مع الكبد بأكمله حتى نقطة زمنية مدتها 12 ساعة. خاصة بالنسبة ل ASGR1. كان مستوى التعبير عن CD81 المرتبط بالغشاء ثابتا لمدة تصل إلى 48 ساعة.وبالمقارنة، زاد تعبير المستقبلات الشبيهة بالرسوم 4 بشكل عام وأصبح أعلى مما كان عليه في مستويات الجسم الحي بعد 48 ساعة. أظهرت اختبارات حساسية الأنسولين أن الأنسولين عزز بشكل كبير الفسفرة لكل من AKT في سيرين 473. وصندوق رأس الشوكة 01 في سيرين 256 ، في خلايا الكبد.الإشارة إلى حساسية خلايا الكبد الأولية للأنسولين. زادت مستويات بروتين فوسفونولبيروفات كاربوكسيكيناز بشكل كبير بعد علاج الجلوكاجون. مما يشير إلى أنه تم تنشيط مسار إنتاج الجلوكوز.تم تأكيد هذا التنشيط بشكل أكبر من خلال زيادة إنتاج الجلوكوز. ومع محفزات إنتاج الجلوكوز الأخرى مثل Forskolin + IBMX. يمكن لهذا البروتوكول توفير الوقت والطاقة للدراسات التي تستخدم خلايا الكبد الأولية للماوس.باتباع هذا البروتوكول ، يمكن إجراء التجارب ذات الصلة مثل استقلاب الجلوكوز الافتراضي واختبارات المؤشرات الحيوية الصيدلانية.

an-improved-time-labor-efficient-protocol-for-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا، وتبين لنا نهجا الأنزيمية لعزل خلايا الكبد الأولية من الفئران الكبار، ونحن تصف الكمي لاستجابة التهابية باستخدام ELISA وفي الوقت الحقيقي PCR.

تحريض استجابة التهابية في الثقافات الابتدائية الكبدية من الفئران

والهدف من هذا البروتوكول الحصول على صلاحية عالية وعالية الغلة من خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد. يتم ذلك عن طريق بيرفوسينج في الكبد مع حل نوع كولاجيناز الرابع عن طريق الوريد البابي، متبوعاً بالطرد المركزي التفاضلي للحصول على خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية.

تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية ووظيفية. وقدمت إرشادات للكشف عن البروتين الوليدة كبدي من الركازة التوسيم غير المشعة للمساعدة في فهم الآليات الأساسية تخليق البروتين في سياق التوازن الطاقة الأيض في الكبد.

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

المقدمة هنا هو بروتوكول لعزل الخلايا الكبدية الماوس من كبد الفار الكبار باستخدام تقنيه ترويه المعدلة كولاجيناز. كما يوصف هو ثقافة طويلة الأجل من الخلايا الكبدية في اعداد ساندويتش الكولاجين 3d ، فضلا عن المناعية للمكونات خلوي لدراسة تشكيل الصفراوية كاناليكاجي واستجابتها للعلاج.

العزلة والكولاجين 3D ساندويتش الثقافة من الخلايا الكبدية الماوس الاساسيه لدراسة دور Cytoskeleton في الصفراء الصفراوية تكوين في المختبر

يفصل هذا البروتوكول استخدام قسطرة وريدية خاصة ، وأنابيب معقمة موحدة يمكن التخلص منها ، والتحكم في درجة الحرارة تكملها مراقبة في الوقت الفعلي ، ونظام إنذار لإجراء تروية الكولاجيناز المكون من خطوتين لتحسين الاتساق في صلاحية خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة وإنتاجيتها ووظائفها.

عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

الأحماض الدهنية β الأكسدة هو مسار استقلابي أساسي مسؤول عن توليد الطاقة في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك خلايا الكبد. هنا ، نصف طريقة لقياس أكسدة β الأحماض الدهنية في خلايا الكبد الأولية المعزولة حديثا باستخدام 14حمض بالمتيك المسمى C.

قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا

هنا نوجز ونوضح بروتوكولا لعزل الخلايا البطانية الجيبية الأولية لكبد الفأر (LSEC). يعتمد البروتوكول على تروية كولاجيناز الكبد ، وتنقية الخلايا غير المتنية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة ، واختيار الخرزة المغناطيسية CD146. نحن أيضا النمط الظاهري ونوصيف هذه LSECs المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني الماسح.

عزل وتوصيف الخلايا البطانية الجيبية الأولية للكبد الفأر

يصف هذا البروتوكول تقنيات عزل خلايا الكبد الأولية للفئران عن الكبد وتحويل CRISPR-Cas9 كهربائيا كبروتينات ريبية و mRNA لتعطيل جين مستهدف علاجي مرتبط بمرض استقلابي وراثي في الكبد. تؤدي الطرق الموصوفة إلى قابلية عالية للاستمرار ومستويات عالية من تعديل الجينات بعد العزل الكهربائي.

التسليم بوساطة الكهربية للبروتينات الريبونوكليوكرية Cas9 والحمض النووي الريبي المرسال إلى خلايا كبد الفئران الأولية المعزولة حديثا

خلايا الكبد المحملة بالدهون متأصلة في تجديد الكبد ولكنها عادة ما تضيع عند الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هنا ، نقدم بروتوكول عزل الخلايا الأمثل الذي يحتفظ بخلايا الكبد الدهنية ، مما ينتج عنه مجموعات تمثيلية من خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران.

عزل خلايا الكبد المتجددة بعد استئصال الكبد الجزئي في الفئران

يقدم هذا البروتوكول تقنية تروية كبد كولاجيناز محسنة من خطوتين في نموذج الفئران ويظهر استخدام خلايا الكبد المعزولة للثقافة طويلة الأجل في المختبر من عضويات 3D.

نضح كبد الفئران وعزل خلايا الكبد الأولية: إجراء قديم حاسم لثقافة المواد العضوية 3D المتطورة

اكتشف بروتوكولاً محسّناً لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران بكفاءة زمنية وتقليل الجهد، باستخدام مضخة تمعّجية ووسط كولاجيناز. يُحسّن هذا الأسلوب نقاوة الخلايا ووظائفها الأيضية.

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات