طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

الهدف العام من تقنية المقاصة هذه هو إنشاء طريقة لإزالة الأنسجة لدماغ الفئران. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للفأر المعدلة وراثيا فيروس نقص المناعة البشرية -1. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن ترك أنسجة دماغ الفئران سليمة للتطهير مما يسمح بتحليل مستوى الدائرة بالكامل.

ستظهر الإجراء كريستين كيرشنر ، مرشحة الدكتوراه من مختبري ، وكذلك هايلونج لي ، باحث مشارك من مختبري. بعد إجراء نضح عبر القلب في فأر عمره ثلاثة إلى ستة أسابيع ، قم بإزالة الدماغ من الجمجمة باستخدام الملقط. ثم ضعه في وضع سهمي وقم بتقطيعه إلى أربعة أقسام متساوية بعرض ثلاثة ملليمترات باستخدام شفرة حلاقة ومصفوفة دماغ الفئران.

قم بإصلاح كل قسم بنسبة أربعة بالمائة من PFA في أنبوب بلاستيكي مغلق سعة خمسة ملليلتر طوال الليل على شاكر عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، استمر في التثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. اغسل كل قسم ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 30 دقيقة لكل غسلة.

احتضان الأقسام المغسولة بشكل متسلسل في محلول الميثانول 20 و 40 و 60 و 80 و 100٪ لمدة ساعة واحدة لكل منها. كرر الجفاف مع 100٪ ميثانول. ثم قم بتبريد العينات في 100٪ ميثانول عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

قم بإعداد محلول يحتوي على 66٪ DCM و 33٪ ميثانول واحتضان الأقسام المبردة في هذا المحلول طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع الرج. في اليوم التالي ، اغسل العينة مرتين بالميثانول لمدة 30 دقيقة وقم بتبريدها في 100٪ ميثانول عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. للتبييض ، ضع العينة في بيروكسيد الهيدروجين الطازج بنسبة خمسة بالمائة في الميثانول واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة الليلية ، قم باحتضان العينة بشكل متسلسل في محاليل 80 و 60 و 40 و 20٪ من الميثانول لمدة ساعة واحدة لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان العينة في PBS لمدة ساعة واحدة واغسلها مرتين في محلول واحد لمدة ساعة واحدة لكل غسلة. املأ حقنة سعة مليلتر واحد ب 2.5 ميكرولتر من واحد بالمائة من البيوتين CTB وحقنها ببطء في موقع النواة المتكئة على مدار 20 ثانية.

اترك طرف الإبرة في مكانه لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالته ببطء على مدى 10 ثوان لمنع التسرب. احتضان العينة في المحلول الثالث ثم المحلول الرابع لمدة يومين في حمام مائي 37 درجة مئوية. ثم أضف الجسم المضاد الأساسي واستمر في الحضانة لمدة سبعة أيام.

اغسل العينة خمس مرات في محلول اثنين لمدة ساعة واحدة لكل غسلة وقم بتخزينها في محلول اثنين في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. احتضان العينة بجسم مضاد ثانوي لمدة سبعة أيام في حمام مائي 37 درجة مئوية. أخيرا ، اغسله خمس مرات في محلول اثنين لمدة ساعة واحدة لكل غسلة وقم بتخزينه في محلول اثنين في درجة حرارة الغرفة طوال الليل في الإضاءة المنخفضة.

احتضان العينة بشكل متسلسل في 20 و 40 و 60 و 80 و 100٪ ميثانول لمدة ساعة واحدة لكل منها في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضانه في الميثانول الطازج بنسبة 100٪ طوال الليل. في اليوم التالي ، احتضان العينة في 66٪ DCM محضرة حديثا في 33٪ ميثانول لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة مع الرج.

بعد ثلاث ساعات ، احتضان العينة في ديبنزيل الأثير دون اهتزاز حتى تصبح صافية. ثم قم بتخزينه في ديبنزيل الأثير حتى التصوير. احصل على غرفة طابعة ثلاثية الأبعاد وقم بتثبيتها في شريحة مجهر باستخدام الايبوكسي.

ضع العينة في المساحة المربعة في منتصف الغرفة واملأ الغرفة بالكامل بإيثر ثنائي بنزيل. ضع غطاء بسمك 0.17 ملم فوق الغرفة واضغط للتأكد من ملامستها الكاملة لجدران الغرفة. ثم ختم الحواف باستخدام الايبوكسي.

تأكد من تدوير الغرفة للسماح لفقاعات الهواء بالخروج من مدخل التعبئة. املأ الغرفة بإيثر ثنائي بنزيل إضافي. ثم أغلق مدخل الحشوة بالإيبوكسي واتركه يشفي.

راقب العينة باستخدام نظام مجهر متحد البؤر لإجراء مسح z بتكبير أربعة أضعاف. تظهر الصورة متحدة البؤر لعينة الأنسجة التي تم تطهيرها بالماء عند التكبير أربع مرات تلطيخا كثيفا ل TH في منطقة المادة السوداء ، والخلايا العصبية TH المتناثرة المجاورة للمادة السوداء ، ومنطقة سوداء داكنة من الأنسجة التي تفتقر إلى الخلايا العصبية TH. التشكل النموذجي للخلايا العصبية الإيجابية TH عند التكبير 20 مرة له سوما كبير والعديد من العمليات المتفرعة.

في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة الملطخة ب IBA1 لها أجسام خلوية صغيرة وعمليات تمديد أقصر. تظهر الصورة متحدة البؤر المثالية تلطيخ TH إيجابيا وكثيفا في منطقة المادة السوداء مع كسب مضان مناسب. تتضمن أمثلة الصور متحدة البؤر الضعيفة صورة مركزة بشكل غير صحيح مع الكثير من اكتساب الفلورسنت ، وتلوين إيجابي كاذب مع بقع ساطعة لا تركز على بقية الأنسجة ، وتلطيخ الخلفية العالي نتيجة استخدام مصل حجب لا يتطابق مع الجسم المضاد الثانوي.

تلطيخ CTB الإيجابي في دماغ الفئران. الألياف الرفيعة الطويلة هي نتوءات واردة على طول مسار الدوبامين. يتيح تحديد موقع TH و CTB تصور موقع الحقن في منطقة النواة المتكئة التي تظهر على شكل دائرة خضراء فلورية كثيفة.

يظهر هنا تحديد موقع TH و CTB في المادة السوداء. أهم الأشياء التي يجب تذكرها عند محاولة هذا الإجراء هي السماح للعينة بالكثير من الوقت لاحتضان جميع محاليل الأجسام المضادة ومتسع من الوقت للمسح الكامل قبل التصوير. يجب أن يكون للعينة تعرض محدود للهواء لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف العينة.

هذه التقنية متعددة الاستخدامات ويمكن استخدامها للتحقيق في العديد من البروتينات المختلفة ذات الأهمية في مناطق مختلفة من الدماغ. تساعد التقنية الحالية في تمهيد الطريق لعلماء الأعصاب للتحقيق في دماغ الفئران على مستوى الدائرة وهو أمر ضروري لدراسة الدماغ كنظام كل.