التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية
نوفمبر 12, 2020
تهدف هذه المقالة إلى تقديم بروتوكول حول كيفية بناء مجهر التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (svFCS) لقياس الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية.
يزال العرض الحالي للتنظيم الجانبي لغشاء البلازما غير مكتمل. لهذا السبب ، من المهم تنفيذ بعض التقنيات المبتكرة الجديدة مثل التباين الموضعي والتحليل الطيفي للارتباط الفلوري. هذه تقنية قوية للغاية تتميز بالوقت الممتاز والدقة المكانية.
علاوة على ذلك ، فهو غير جراحي ويجعل من الممكن دراسة أغشية الخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية. كل يوم قبل إجراء التجربة ، افتح جميع أغشية القزحية واستخدم مقياس الطاقة لقياس طاقة الليزر مع فتح القزحية الأولى بالكامل. أدر لوحة المنتصف لتحديد الطاقة القصوى.
إذا كانت قوة الليزر أقل من المعتاد ، فاستخدم القزحية للتحقق من المحاذاة وحرك L1 و M1 بالتناوب حسب الضرورة. ثم لاحظ قيمة الطاقة في دفتر ملاحظات المختبر. للتحقق من مسار الكشف ، ضع الماء وزلة غطاء وقطرة من محلول نانومولار rhodamine 6G على الهدف.
ثم قم بتشغيل برنامج الارتباط وتسجيل البيانات. يجب أن تعرض وظيفة الارتباط التلقائي كمية منخفضة من الضوضاء وحجم نفايات صغير ومعدل عد مرتفع لكل جزيء في الثانية. لمعايرة حجم البقعة ، ضع زلة غطاء مشفرة بزراعة الخلايا على هدف الغمر في الماء وأضف 200 ميكرولتر من محلول نانومولار rhodamine 6G إلى زلة الغطاء.
اضبط طاقة شعاع الليزر 488 نانومتر على 300 ميكروواط وفي البرنامج ، حدد منفذ مجهر الكشف عن الإضاءة svFCS. قم بتشغيل APD وافتح القزحية حتى تسقط إشارة للحصول على الحد الأدنى لحجم النفايات أو أغلقها للحصول على حجم نفايات أكبر. سجل حوالي 10 وظائف ارتباط تلقائي مدتها 20 ثانية لتحسين قابلية التكرار الإحصائي وإيقاف تشغيل APD.
في برنامج تحليل البيانات المناسب ، تحقق من عمليات التشغيل ذات التقلبات القوية بسبب المجاميع الجزيئية وتجاهلها ، ثم قم بتركيب متوسط وظيفة الارتباط التلقائي المحتفظ بها مع نموذج انتشار ثلاثي الأبعاد ، واستخرج متوسط وقت الانتشار من معلمات التركيب واحفظ البيانات كملف TXT. لتحليل svFCS ، اضبط شعاع 488 نانومتر يعمل بالطاقة بين اثنين إلى أربعة ميكرووات وقم بموازنة العينات لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. حدد منفذ مجهر الكشف عن الإضاءة svFCS ، وعلى APD.
بعد ذلك ، قم بإجراء فحص XY ومسح Z للخلية المحددة. حدد غشاء البلازما في الجزء العلوي من الخلية لتحديد موقع البقعة متحد البؤر بأقصى شدة مضان وبدء الحصول على البيانات. في برنامج الارتباط ، سجل سلسلة واحدة من 20 ، خمس ثوان.
بعد التشغيل الأخير ، قم بإيقاف تشغيل APD وتجاهل أي عمليات تشغيل غير متوقعة كما هو موضح. قم بتركيب متوسط وظيفة الارتباط التلقائي مع نموذج انتشار ثنائي الأبعاد ثنائي الأنواع واحفظ معلمات التركيب في ملف TXT المحفوظ مسبقا. عندما يتم تسجيل جميع الخلايا ذات الأهمية ، قم بتحليل ما لا يقل عن أربعة أحجام نفايات تتراوح بين 200 إلى 400 نانومتر لإنشاء قانون انتشار واحد.
ثم في MATLAB ، حدد مجلدا يحتوي على جميع ملفات TXT المقابلة لأربع تجارب على الأقل لحجم النفايات ورسم وقت الانتشار مقابل النفايات المربعة. في هذا الشكل ، يمكن ملاحظة قانون الانتشار ل Thy1-GFP المعبر عنه في خلايا Cos7. قانون الانتشار له قيمة زمني موجبة صفرا ، مما يشير إلى أن Thy1-GFP محصور في هياكل مجال النانو لغشاء البلازما.
في هذا التحليل ، أدى علاج أوكسيديز الكوليسترول للخلايا التي تعبر عن Thy1-GFP إلى تحويل قيمة وقت قانون الانتشار صفر إلى 7.36 زائد أو ناقص 1.34 مللي ثانية. التأكيد على أن طبيعة حبس Thy1-GFP تعتمد على محتوى الكوليسترول ويرتبط بمجالات نانو طوف الدهون. كما لوحظ انخفاض طفيف ولكنه كبير في محتوى الكوليسترول الكلي عند العلاج بأكسيديز الكوليسترول.
نظرا لأن هذا الإنزيم يعمل فقط على تجمع الكوليسترول الذي يمكن الوصول إليه في النشرة الخارجية لغشاء البلازما ، فإن هذه البيانات تشير إلى أن الانخفاض الملحوظ في الكوليسترول يرتبط فقط بغشاء البلازما ويسبب زعزعة استقرار مجالات نانو الطوفة الدهنية. أهم شيء عند محاولة هذا الإجراء هو المعايرة المناسبة لنظام svFCS وإعداد الخلايا للتحليل. svFCS هي أداة ممتازة لدراسة تنظيم غشاء الخلية.
ومع ذلك ، يمكن استخدامه أيضا لتحليل انتشار الجزيئات داخل الخلايا. يمكن تنفيذ هذه التقنية بنجاح في الطب الحيوي من أجل تحديد تأثير الأدوية المحتملة على الخلايا الحية مثل الخلايا السرطانية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لبناء مجهر مطيافية الارتباط الفلوري بتباين البقع (svFCS) لقياس الانتشار الجزيئي عند الغشاء البلازمي للخلايا الحية. وتوفر هذه التقنية دقة زمنية ومكانية ممتازة، كما أنها غير اجتياحية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- المجهر الفلوري
خلفية علمية
- لا يزال التنظيم الجانبي للغشاء البلازمي غير مفهوم بشكل كامل.
- هناك حاجة إلى تقنيات مبتكرة مثل svFCS للحصول على رؤى أفضل.
- تتيح تقنية svFCS دراسة أغشية الخلايا تحت ظروف فسيولوجية.
- يعد المعايرة السليمة وتحضير الخلايا أمرين حاسمين للحصول على نتائج دقيقة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لمجهرية svFCS.
- قياس الانتشار الجزيئي عند الغشاء البلازمي.
- تحليل تأثير الكوليسترول على تنظيم الغشاء.
الطرق المستخدمة
- معايرة نظام svFCS باستخدام محلول رودامين 6G.
- جمع البيانات من خلال عمليات مسح XY و Z لخلايا مختارة.
- تحليل قوانين الانتشار باستخدام برنامج MATLAB.
- مقارنة بارامترات الانتشار قبل وبعد المعالجة بإنزيم كوليسترول أوكسيداز.
النتائج الرئيسية
- يقتصر انتشار Thy1-GFP ضمن بنى النطاقات النانوية.
- تؤدي المعالجة بإنزيم أكسيداز الكوليسترول إلى إزاحة قيمة الزمن صفر لقانون الانتشار.
- لوحظ انخفاض في المحتوى الكلي للكوليسترول.
- تشير الدراسة إلى أن الكوليسترول يؤثر على استقرار الطوافة الدهنية.
الاستنتاجات
- تعد تقنية svFCS فعالة لدراسة تنظيم الغشاء الخلوي.
- يمكن لهذه التقنية أيضاً تحليل انتشار الجزيئات داخل الخلايا.
- لهذه النتائج انعكاسات على فهم تأثيرات الأدوية على الخلايا الحية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تتيح تقنية مطيافية الارتباط الفلوري بتغيير بقعة التركيز (svFCS) تحليلاً عالي الدقة للانتشار الجزيئي عند الغشاء البلازمي في ظل الظروف الفسيولوجية، مما يوفر رؤى بالغة الأهمية حول تنظيم الغشاء وديناميكيات الطوافات الدهنية. وتدعم هذه القدرة عملية التحقق من الأهداف عن طريق توضيح السياق الفيزيائي الحيوي للبروتينات المرتبطة بالغشاء، مما يساهم في تقليل المخاطر الميكانيكية في مراحل الاكتشاف المبكرة. كما تعزز الطبيعة غير الغازية لهذه الطريقة وتوافقها مع الخلايا الحية من فائدتها في الفحص قبل السريري ودراسات المؤشرات الحيوية الانتقالية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس سلوك انتشار بروتينات الغشاء مثل Thy1-GFP ضمن هياكل النطاقات النانوية.
- القيمة التشغيلية: الكشف عن الحصر المعتمد على الكوليسترول، مما يسمح بالتحقق الوظيفي من الارتباطات بـ lipid raft.
- القيمة التنبؤية: دعم عملية فرز المحفظة الدوائية من خلال تحديد الأهداف التي يكون تموضعها الغشائي حساساً للاضطرابات في البيئة الدهنية.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تحضير الأنظمة البيولوجية المعتمدة لفحص المركبات من خلال تحديد قوانين الانتشار المرجعية تحت الظروف الفسيولوجية.
- المخرجات الكمية: توليد قياسات زمن انتشار قابلة للتكرار عبر أحجام مختلفة لخصر الشعاع، مما يدعم توحيد معايير المقايسة.
- أهمية الفحص: الكشف عن التحولات في معاملات الانتشار الناتجة عن المركبات، مما يشير إلى حدوث تغيرات في تنظيم الغشاء أو الارتباط بالهدف.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الصلة بالمرض: ينمذج تعطل النطاقات النانوية للغشاء البلازمي، وهو أمر ذو صلة بالاعتلالات المرضية التي تتضمن خللاً في تنظيم الدهون.
- الاستمرارية الترجمية: يربط ملاحظات الاكتشاف المبكر بالتحقق قبل السريري من خلال توضيح كيف تؤدي الاضطرابات البيئية (مثل تعديل الكوليسترول) إلى تغيير سلوك الهدف.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: يوفر قراءات ميكانيكية تساعد في تحديد معايير المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) بناءً على مدى مرونة الهدف تجاه اضطرابات الغشاء.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يتناسب نظام svFCS ضمن سلسلة الاكتشافات المتصلة، بدءاً من اختبار فرضيات الأهداف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى التحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية، حيث يوفر طبقة توصيف فيزيائية حيوية تكمل المقاييس الكيميائية الحيوية والنمطية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس معاملات الانتشار وتحديد المجموعات الجزيئية المقيدة مقابل المتحركة.
- الفحص: تتيح جاهزية المقايسة من خلال المعايرة الموحدة باستخدام rhodamine 6G والتحقق من سلامة مسار الكشف.
- التحليلات: تقدم قوانين انتشار كمية عبر تحليل MATLAB لدوال الارتباط الذاتي، مما يسمح بمقارنة السلوك الجزيئي عبر ظروف مختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط التغيرات في تنظيم الغشاء بالنتائج الوظيفية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية عندما ترتبط تحولات الانتشار بالاستجابات المظهرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة ديناميكيات بروتينات الغشاء عبر أهداف وخطوط خلوية متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال تحليل الحصر في المقياس النانوي وعدم تجانس الانتشار عند الغشاء البلازمي.
- القيمة التشغيلية: يضمن قابلية التكرار من خلال معايرة موحدة لقدرة الليزر، وفحوصات مسار الكشف، ومتوسط دالة الارتباط التلقائي المكررة.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المتابعة أو التوقف من خلال قياس استقرار الهدف في بيئات غشائية شبيهة بالبيئة الطبيعية، مما يقلل من حالات الفشل في المراحل المتأخرة الناتجة عن مسؤوليات بيوفيزيائية غير متوقعة.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على المخاطر المعدلة، وذلك بالاستناد إلى مدى اعتمادها على سلامة الطوافة الدهنية من أجل التموضع والوظيفة الصحيحين.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر الفلوري، وسلامة الليزر، وتحليل بيانات مطيافية الارتباط.
- يتطلب مجهراً فلورياً مخصصاً مزوداً بكاشف فوتونات مجهري (APD)، وبرمجيات الارتباط، وتحكماً دقيقاً في قدرة الليزر (2–4 µW لقياسات svFCS).
- يستلزم توحيداً بين الفرق في بروتوكولات المعايرة (مثل التحقق من حجم بقعة rhodamine 6G) ومسارات تحليل البيانات (مثل ملاءمة نماذج الانتشار ثنائية الأبعاد باستخدام MATLAB).
- يتضمن اعتبارات التكييف لمختلف البروتينات الغشائية، وأنواع الخلايا، وعوامل الاضطراب الأخرى غير أكسيداز الكوليسترول.
- يقتصر على الحاجة إلى تحضير دقيق للعينات لتجنب التجمعات الجزيئية وضمان الملاءمة الفسيولوجية أثناء التوازن عند 37°C.
